一种猪流行性腹泻病毒低含量样品的病毒分离方法技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)低含量样品的病毒分离方法，还公开了用于猪流行性腹泻病毒富集和分离的免疫纳米磁珠，该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe2O3核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面。传统方法从多重感染和低PEDV含量样品中分离病毒，需要病毒纯化和长时间盲传，分离效率低，限制了PEDV的研究工作。本发明专利技术利用纳米磁珠和PEDV特异性单域抗体制备了免疫纳米磁珠，能够有效捕获和富集粪便、组织等多种样品中的PEDV。样品经处理后利用免疫纳米磁珠进行病毒捕获和富集，将结合病毒的免疫纳米磁珠直接接种到Vero细胞，即可实现对病毒分离。本发明专利技术制备的免疫纳米磁珠和PEDV分离方法，适用于临床复杂和低病毒含量样品中PEDV的快速、有效分离。

* a virus isolation method for low content samples of porcine epidemic diarrhea virus

The invention discloses a virus isolation method for a low content sample of * * porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and discloses an immune nano magnetic bead used for enriching and separating porcine epidemic diarrhea virus. The immunomagnetic bead has a magnetic Fe2O3 core and a surface coupled with a PEDV membrane protein specific single domain antibody. Traditional methods for isolation of viruses from samples with multiple infections and low PEDV content require viral purification and long-term blind transmission. The low isolation efficiency limits the research work of PEDV. The invention utilizes nanometer magnetic beads and PEDV specific single domain antibody to prepare immune nanometer magnetic beads, which can effectively capture and enrich PEDV in feces, tissues and other samples. After treatment, the virus was captured and enriched by immunomagnetic nanobeads, and the virus-binding immunomagnetic nanobeads were directly inoculated into Vero cells to isolate the virus. The immune nanometer magnetic beads and the PEDV separation method prepared by the invention are suitable for the rapid and effective separation of PEDV in clinical complex and low viral content samples.

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒低含量样品的病毒分离方法
本专利技术涉及一种用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离的免疫纳米磁珠，还涉及PEDV低含量临床样品的病毒高效分离方法。本专利技术属于生物

技术介绍
猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，PEDV)属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)成员，是引起猪流行性腹泻(PED)的病原。PED是以感染猪的腹泻、呕吐和脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，各种年龄的猪都能感染发病，尤其对哺乳仔猪具有较高致死率。猪流行性腹泻发病区域遍及全球，给养猪业带来巨大危害。对临床上患PED猪样品中病毒的快速分离鉴定，是研究PEDV流行病学、分子生物学以及高效疫苗研制的必要环节。然而，目前临床病原感染复杂多样，已经罕见单一病原感染的临床病例，这种情况使用常规方法对单一病原分离十分困难。同时对于一些低病原含量样本，使用常规方法分离也很难获得成功。因此，建立对临床多重感染和低病原含量样品中的目标病原有效分离的方法，对病原学、流行病学和疫苗等研究具有重要意义。免疫磁珠在生命科学领域应用日渐普遍，尤其在病原检测和分离等方面。免疫磁珠分离技术是以抗体包被的磁珠为载体，利用抗原、抗体的特异性结合形成抗原-抗体-磁珠复合物，该复合物在磁场作用下可定向运动，从而实现抗原的特异性地分离。该方法结合了分散固相萃取的高效性、免疫亲合作用的特异性及磁回收的简便性，可有效简化前处理流程，缩短前处理时间，提高富集和分离效率。随着纳米磁珠制备和表面包被技术的不断成熟完善，各种抗体以及特异性亲和因子等都可用于磁珠包被，从而获得免疫磁珠，这些免疫磁珠的特异性则完全取决于包被的抗体或亲和因子。目前，常用的主要抗体包括单克隆抗体(IgG)、单链抗体、单域抗体(sdAb)等。单域抗体是骆驼科和软骨鲨鱼等血清天然存在的仅有重链的IgG抗体，该类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区的单一结构域组成，又称为重链抗体(VHH)或纳米抗体(Nanobody，Nb)。sdAb同普通IgG抗体分子一样保持了良好的、特异的抗原结合能力。同时，sdAb还具有易于在大肠杆菌表达系统中可溶性表达、耐高温、耐极度pH值等独特性质。这些特性使sdAb成为免疫磁珠制备的理想候选抗体。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种能够结合并高效富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，PEDV)的免疫纳米磁珠；本专利技术的另一目的是提供一种PEDV低含量样品病毒有效分离的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，PEDV)的免疫纳米磁珠，该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe2O3核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面，该PEDV膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，本专利技术还提出了一种制备所述的免疫纳米磁珠的方法，包括以下步骤：(1)纳米磁珠的活化取带有羧基表面的Fe2O3纳米磁珠，加入离心管，用无菌PBS缓冲液洗3次，用磁力架收集磁珠，然后向有磁珠的离心管中加入0.4mol/L的EDC和0.2mol/L的NHS，活化磁珠表面，用PBS缓冲液洗5次，备用；(2)包被抗体缓冲液置换取PEDV膜蛋白特异性单域抗体溶液，利用超滤管更换溶解缓冲液为PBS缓冲液，备用；(3)免疫纳米磁珠制备取已更换缓冲液的PEDV膜蛋白特异性单域抗体溶液，加入有活化磁珠的离心管，置37℃，120rpm摇动，孵育2h，用PBS缓冲液洗5次，收集磁珠，然后用质量体积比为0.1％的牛血清白蛋白，置37℃，封闭30min，收集磁珠，用含体积比为0.01％叠氮钠，10％甘油的PBS缓冲液重悬，即得，4℃储存备用。其中，优选的，所述的带有羧基表面的Fe2O3纳米磁珠的直径为200nm。其中，优选的，加入的0.4mol/L的EDC和0.2mol/L的NHS的体积比为1:1。其中，优选的，步骤(1)-(3)中所述的PBS缓冲液的pH值均为7.4。更进一步的，本专利技术还提出了一种PEDV低含量样品病毒有效分离的方法，即利用本专利技术所述的免疫纳米磁珠对低病毒含量临床样品中的PEDV进行捕获和富集，在通过细胞分离传代，实现病毒分离。其中，优选的，所述的方法的具体步骤为：a.免疫纳米磁珠与样品共孵育：将临床疑似PEDV感染猪粪便以及分泌物棉拭子类型样品或组织样品，用无菌PBS缓冲液浸泡或组织匀浆，与免疫纳米磁珠，室温，80rpm，共孵育1h，用无菌PBST洗5次，磁力架收集免疫纳米磁珠；b.免疫纳米磁珠与病毒复合物接种细胞：用含100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM，洗免疫纳米磁珠5次，磁力架收集，与1mL含5μg/mL胰酶，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM混合，并加入到细胞表面，37℃，5％CO2，孵育1h；c.更换细胞培养液：加入含5μg/mL胰酶，100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基，37℃，5％CO2继续培养24h，开始观察细胞病变(CPE)，并进行病毒传代，实现病毒分离。其中，优选的，步骤a中所述的PBS缓冲液的pH值为7.4，步骤b中所述的细胞为vero细胞。以上所述的猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，PEDV)膜蛋白特异性单域抗体及其核苷酸序列也在本专利技术的保护范围之内，所述的猪流行性腹泻病毒膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用纳米磁珠和PEDV特异性单域抗体制备了免疫纳米磁珠，能够有效捕获和富集粪便、组织等多种样品中的PEDV。样品经处理后利用免疫纳米磁珠进行病毒捕获和富集，将结合病毒的免疫纳米磁珠直接接种到细胞，即可实现对病毒分离。本专利技术制备的免疫纳米磁珠和PEDV分离方法，适用于临床复杂和低病毒含量样品中PEDV的快速、有效分离。附图说明图1为PEDV特异性sdAb的序列分析、表达和纯化；A：通过TheKabatetal.(Kabat,1991)方式进行骨架和互补决定区划分。(Kabat,E.A.,1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth.)。B：表达与纯化.泳道1，空白对照；泳道2，表达；泳道3，纯化；M，蛋白分子量标准。C：ELISA实验分析sdAb-Mc40与M蛋白结合活性。图2为免疫纳米磁珠对M蛋白结合活性分析；重组表达M蛋白与免疫纳米磁珠共孵育，通过SDS-PAGE检测结合情况，并通过westernblot验证，利用PEDV抗体阳性猪血清为一抗，HRP标记的兔抗猪抗体为二抗；泳道1，免疫纳米磁珠结合的M蛋白；泳道2，使用的总重组M蛋白；泳道3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒(poreine epidemic diarrhea virus，PEDV)的免疫纳米磁珠，其特征在于该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe2O3核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面，该PEDV膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemicdiarrheavirus，PEDV)的免疫纳米磁珠，其特征在于该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe2O3核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面，该PEDV膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种制备权利要求1所述的免疫纳米磁珠的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)纳米磁珠的活化取带有羧基表面的Fe2O3纳米磁珠，加入离心管，用无菌PBS缓冲液洗3次，用磁力架收集磁珠，然后向有磁珠的离心管中加入0.4mol/L的EDC和0.2mol/L的NHS，活化磁珠表面，用PBS缓冲液洗5次，备用；(2)包被抗体缓冲液置换取PEDV膜蛋白特异性单域抗体溶液，利用超滤管更换溶解缓冲液为PBS缓冲液，备用；(3)免疫纳米磁珠制备取已更换缓冲液的PEDV膜蛋白特异性单域抗体溶液，加入有活化磁珠的离心管，置37℃，120rpm摇动，孵育2h，用PBS缓冲液洗5次，收集磁珠，然后用质量体积比为0.1％的牛血清白蛋白，置37℃，封闭30min，收集磁珠，用含体积比为0.01％叠氮钠，10％甘油的PBS缓冲液重悬，即得，4℃储存备用。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的带有羧基表面的Fe2O3纳米磁珠的直径为200nm。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于加入的0.4mol/L的EDC和0.2mol/L的NHS的体积比为1:1。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)-(3)中所述的PBS缓冲液的pH值均为7.4。6.一种猪流行性腹泻病毒(poreineepide...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨顺利，尹双辉，蔡建平，李丽，尚佑军，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62