一种噬菌体鸡尾酒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种噬菌体鸡尾酒及其应用，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：(1)噬菌体NJ‑P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099；(2)噬菌体NB‑P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100；(3)噬菌体NC‑P34，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018101；(4)噬菌体NN‑P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102；上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridae phage。四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体进行组合对青枯病的防治具有显著的协同增效作用。

A bacteriophage cocktail and its application

The invention discloses a bacteriophage cocktail and its application. The bacteriophage composition comprises four bacterial-specific lysing phages isolated from different areas: (1) bacteriophage NJ_P3, preservation number: CCTCC NO: M 2018099; (2) bacteriophage NB_P21, preservation number: CCTCC NO: M 20100. (3) Phage NC_P34, preservation number: CCTCC NO: M 2018101; (4) Phage NN_P42, preservation number: CCTCC NO: M 2018102; The above-mentioned phages were preserved in China's Typical Culture Preservation Center on March 6, 2008, classified as Podoviridae phage. The combination of four bacterial wilt specific lysing phages isolated from different areas had significant synergistic effect on the control of bacterial wilt.

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体鸡尾酒及其应用
本专利技术属于环境友好型生防制剂，涉及噬菌体鸡尾酒(即噬菌体组合物)及其应用，专用于防治土传青枯病问题。
技术介绍
土传青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性病害，目前在我国大部分地区都有发生，南方地区病情较重。目前科学家已从自然环境中分离筛选出大量青枯菌专性噬菌体，并研究它们应用效果和作用机制。由于噬菌体疗法大多数只考察了单一噬菌体的效果，而且抑病效果往往不稳定，噬菌体疗法还未得到广泛的认可和大面积推广。综合分析发现单一噬菌体疗法存在以下局限性：噬菌体具有高度的特异性，宿主范围窄，所以噬菌体往往只对某一型或几型的宿主细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用。2)青枯菌基因组中的大质粒携带了有助于提高青枯菌致病及适应能力的基因簇或遗传岛。对于单一噬菌体侵染胁迫，青枯菌很容易进化适应形成抗性，甚至会诱导青枯菌致病性增加。3)噬菌体具有“原位适应性”，即噬菌体更容易侵染来自同一块土壤的细菌，而对来自其他土壤中的细菌感染力相对较弱，这制约噬菌体疗法的广泛的应用。为提高噬菌体疗法在土传青枯病防控中的应用效果，我们利用分离自不同地区的4株青枯菌专性裂解性噬菌体构建了不同丰富度的噬菌体鸡尾酒，探究了噬菌体鸡尾酒在盆栽条件下抑制青枯菌入侵番茄根际的能力。
技术实现思路
针对土传青枯病病原菌(Ralstoniasolanacearum)种间遗传复杂、变异性强，单一噬菌体制剂防治效果不稳定的问题，提出利用来自环境中具有高效裂解作用的噬菌体构建噬菌体鸡尾酒(即噬菌体组合物)的防控方案，探究病原菌响应噬菌体多样性胁迫的机制，为开发高效稳定的噬菌体制剂提供理论和技术支撑。本专利技术的另一目的在于提供上述噬菌体组合物在防治土传青枯病中的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：(1)噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCCNO：M2018099，分离自江苏南京(118°57'E,32°03'N)；(2)噬菌体NB-P21，保藏编号为：CCTCCNO：M2018100，分离自浙江宁波(121°67'E,29°91'N)；(3)噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCCNO：M2018101，分离自江西南昌(115°51′E,28°41′N)；(4)噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCCNO：M2018102，分离自广西南宁(108°21′E,22°49′N)；上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，分类命名为Podoviridaephage。作为一种优选技术方案，上述的噬菌体组合物中各噬菌体所占的比例相同。进一步优选的，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量≥105PFU/mL。更进一步优选的，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量为105～107PFU/mL。上述的噬菌体组合物在防治土传青枯病或制备用于防治土传青枯病的生防制剂中的应用。一种用于防治土传青枯病的生防制剂，该生防制剂包含上述的噬菌体组合物。一种防治作物土传青枯病的方法，将上述的噬菌体组合物，或上述的噬菌体制剂接种到作物的植株根际，所述噬菌体组合物或噬菌体制剂的添加量为≥106PFU/g干土。本专利技术的技术方案做出了如下研究：1)对4株青枯菌裂解性噬菌体进行基础生物学特性及基因组分析；2)利用室内微孔板实验检测噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵的能力；3)利用温室盆栽试验评价噬菌体鸡尾酒防控青枯病的能力，并通过分离根际青枯菌，检测其噬菌体抗性，分析噬菌体多样性效应的机制。本专利技术的有益效果：本专利提供了一种高效抑制青枯病的噬菌体鸡尾酒，并检测了其防控的效果。同时对噬菌体鸡尾酒发挥作用可能的机制进行了探索：噬菌体胁迫通过影响病原菌抗性和致病力的权衡从而抑制病害的发生。实验结果显示，四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体进行组合对青枯病的防治具有显著的协同增效作用。附图说明图1为4株噬菌体在双层琼脂平板上形成噬菌斑。图2为4株噬菌体基因的系统发育树。图3为4株噬菌体基因图谱。图4为4株噬菌体抑制青枯菌的能力。图5为噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵能力。其中，室内的抑菌效果(A)，盆栽实验番茄青枯病的发病率(B)和根际病原菌的数量(C)以及噬菌体的数量(D)。图6为噬菌体诱导青枯菌抗性进化(A)及其与致病性的关系(B)。具体实施方式(一)4株噬菌体的基本特性1)噬菌体的形态宿主细菌：青枯菌，本实验室从南京市麒麟镇发病番茄植株中分离获得的具有强致病力的青枯菌QL-Rs1115(Weietal.2011)，简称RS。青枯菌培养使用NA培养基(葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏0.5g、去离子水1000mL，调节pH7.2-7.4，115℃高压灭菌30min)。4株供试的噬菌体分别分离自南京(NJ-P3)、宁波(NB-P21)、南昌(NC-P34)、南宁(NN-P42)。取0.5mL对数生长期的R.solanacearum菌液与6mL冷却至50℃左右的NA半固体培养基(NA培养基加入1％(g/100ml)琼脂)混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基(NA培养基加入2％琼脂)平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接30μL的梯度稀释的噬菌体原液(106，107，108，109)，30℃倒置培养24h～48h，观察有无噬菌斑。如图1所示，4株噬菌体均为裂解性噬菌体，形成的噬菌斑均为圆形、透明、清晰。分离的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridaephage。噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCCNO：M2018099；噬菌体NB-P21，保藏编号为：CCTCCNO：M2018100；噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCCNO：M2018101；噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCCNO：M2018102。2)噬菌体的基因组利用试剂盒(λ噬菌体DNA提取试剂盒，Abigen)按操作步骤提取噬菌体基因组DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国NanoDrop公司)检测基因组DNA的纯度和浓度，送至上海美吉生物公司进行测序。测序结果表明4株噬菌体基因组大小分别为42.528kb、41.194kb、41.943kb、42.278kb，GC含量分别为62.26％、62.22％、61.99％、62.10％(表1)。将噬菌体的基因组序列与选定的一些标准噬菌体进行BLAST分析并构建系统发育树。如图2所示，我们分离的4株噬菌体中NN-P42与NB-P21，NC-P34YUNJ-P3的同源性很高，且4株噬菌体均属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)。如图3所示，从基因图谱我们可以发现4株噬菌体编码蛋白的基因区域存在差异，GC含量和分布均有一定的差异。表14株噬菌体的基因组大小3)噬菌体的裂解能力利用96微孔板检测供试的4株噬菌体的裂解活性。培养基：NA培养基；接种微生物：即接种活化的RS悬液(106CFU/mL)或噬菌体(105PF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：(1)噬菌体NJ‑P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099；(2)噬菌体NB‑P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100；(3)噬菌体NC‑P34，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018101；(4)噬菌体NN‑P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102；上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridae phage。

【技术特征摘要】
1.一种用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：(1)噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCCNO：M2018099；(2)噬菌体NB-P21，保藏编号为：CCTCCNO：M2018100；(3)噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCCNO：M2018101；(4)噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCCNO：M2018102；上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridaephage。2.根据权利要求1所述的用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，所述的噬菌体组合物中各噬菌体所占的比例相同。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦中，王孝芳，杨可铭，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32