一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及酶联免疫技术领域，公开了一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法。本发明专利技术所述组合物包括封闭液和酶标稀释液；所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300。本发明专利技术从酶联免疫试剂盒的封闭液和酶标稀释液入手，通过选择适宜成分，使得酶联免疫试剂盒能够较长时间保持检测的稳定性。同时，以所述组合物制备的糖尿病检测试剂盒在具有较佳稳定性的基础上，还能够对糖尿病进行准确诊断和分型，特别是针对IAA的检测上，具备较高的阳性率。

A Composition for ELISA Kit and a Kit for Detecting Diabetes Antibody Spectrum and Its Preparation Method

The invention relates to the field of enzyme-linked immunoassay technology, and discloses a composition for enzyme-linked immunoassay kit, a diabetes antibody spectrum detection kit and a preparation method thereof. The composition comprises a blocking solution and an enzyme-labeled diluent, the blocking solution contains BSA, polyvinyl alcohol, mannitol, sodium azide and disodium hydrogen phosphate, and the enzyme-labeled diluent contains Tris, citric acid, BSA, polyethylene glycol, Arabic gum, betaine and Proclin 300. The method starts with the sealing solution and the enzyme-labeled dilution solution of the enzyme-linked immunoassay kit, and by selecting the suitable components, the enzyme-linked immunoassay kit can keep the detection stability for a long time. At the same time, on the basis of better stability, the diabetes detection kit prepared by the composition can also accurately diagnose and type diabetes, especially for IAA detection, and has a higher positive rate.

【技术实现步骤摘要】
一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及酶联免疫
，具体涉及一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
糖尿病(diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。糖尿病在病因，发病机制和自然病程等方面显示高度异质性，所以糖尿病是一组高血糖疾病的总称。糖尿病基于病因和发病机理分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病及其它类型。Ⅰ型糖尿病是以胰岛β细胞自身免疫破坏为重要病因的一种疾病，患者体内存在一种或多种针对胰岛β细胞胰岛素合成、转运和分泌的关键酶的自身抗体，主要包括胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛素自身抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、酪氨酸磷酸抗体(IA-2A)、羧基肽酶抗体(CPH-A)和锌转运蛋白8抗体(ZnT8-A)等6种自身抗体。85％～90％患者在首次检出空腹高血糖时，通常存在一种或多种上述抗体。蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，是近年来发展起来的一项生物检测技术，这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上，利用荧光或酶显色进行探测，最后用特定的计算机软件加以分析。依靠ELISA技术，蛋白质芯片能够快速、高通量、定量分析大量的蛋白样品，以及所需试剂和样品较少，产品化后价格更低廉等优势，使其迅速成为研究热点。但是，目前该类试剂盒的稳定性并不好。此外，该类试剂盒在检测糖尿病胰岛素自身抗体(IAA)的阳性率上存在不足，阳性率较低，容易漏检。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于酶联免疫试剂盒的组合物，使得所述组合物用于制备酶联免疫试剂盒时能够显著提高试剂盒在低温和室温下的稳定性，保存时间延长；本专利技术的另外一个目的在于提供上述组合物在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是用于检测糖尿病的相关试剂盒；本专利技术的另外一个目的在于提供一种包含上述组合物的糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法，使得所述试剂盒在低温和室温下具有较长时间的稳定性，同时检测结果具有较高的特异性和敏感性；本专利技术的另外一个目的在于提供一种包含上述组合物的糖尿病抗体谱检测试剂盒及其制备方法，使得所述试剂盒能够显著提高检测糖尿病胰岛素自身抗体(IAA)的阳性率。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于酶联免疫试剂盒的组合物，包括封闭液和酶标稀释液；所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300。针对现有酶联免疫试剂盒稳定较差、保存时间较短的缺陷，本专利技术意外发现了从制备试剂盒的封闭液和酶标稀释液(用于稀释酶标抗原或抗体用)入手，通过选择合适的组分完善两者的组成，能够显著提高酶联免疫试剂盒的稳定性和保存时间。作为优选，所述封闭液含有0.6％-1％BSA，0.8％-1.5％的聚乙烯醇、0.8％-1.5％甘露醇、0.05％叠氮钠和0.01M磷酸氢二钠，pH值为7.4，余量为水，所述百分比为质量百分比(w/v)；在本专利技术具体实施方式中，所述封闭液含有1％BSA，1％的聚乙烯醇、0.8％甘露醇、0.05％叠氮钠和0.01M磷酸氢二钠，pH值为7.4，余量为超纯水。其中，聚乙烯醇优选为聚乙烯醇2W。作为优选，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1％-3％的聚乙二醇、0.01％的阿拉伯树胶、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300，余量为水，所述百分比中除Proclin300是体积百分比之外，其余都是质量百分比(w/v)；在本专利技术具体实施方式中，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2.5％的BSA、2％的聚乙二醇、0.01％的阿拉伯树胶、1％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300。其中，聚乙二醇优选为聚乙二醇1W。本专利技术利用上述组合物进行糖尿病抗体酶联免疫试剂盒的制备，与采用常规的封闭液和酶标稀释液糖尿病抗体酶联免疫试剂盒相比，在低温(2-8℃)下，本专利技术试剂盒在放置24个月后仍然能够保持制备完成时的稳定性，而对照的试剂盒在放置18个月后就已经出现很大程度的不稳定性；在室温(18-28℃)下，本专利技术试剂盒在放置6个月后仍然能够保持制备完成时的稳定性，在放置8个月后仍然能够保持较高的稳定性，而对照的试剂盒在放置4个月后就已经出现很大程度的不稳定性。基于上述优异的技术效果，本专利技术提出了所述组合物在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是在制备糖尿病酶联免疫检测试剂盒中的应用。同时，本专利技术还提供一种糖尿病抗体谱检测试剂盒，包括以下组分：包被有糖尿病自身抗原的蛋白芯片、用酶标稀释液稀释的酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液；其中，所述蛋白芯片包被糖尿病自身抗原后采用封闭液封闭，所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300，所述封闭液和酶标稀释液与前述组合物方案相同。作为优选，所属包被通过亲和素化的蛋白芯片与生物素化的糖尿病自身抗原相互结合包被。其中，亲和素优选为链霉亲和素。作为优选，所述糖尿病自身抗原选自IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8、IA中的一种或两种以上；在本专利技术具体实施方式中，所述糖尿病自身抗原为IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8和IA(在本专利技术中提到的IA和insulin均表示胰岛素)。在优选的方案中，本专利技术所述试剂盒的蛋白芯片至少包含生物素化的IA作为糖尿病自身抗原，为了能够提高IA抗体IAA的阳性率，本专利技术对IA的生物素化方法进行了改进，将多个胰岛素分子通过SATA以及SMCC偶联到大分子蛋白氨基上，同时大分子蛋白偶联上生物素，形成的Biotin-大分子蛋白-insulin偶联物，结合多个insulin分子和生物素分子(示意图见图1)，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率。其具体步骤如下：步骤1、将insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯(SATA，购自Thermo)室温反应，透析纯化(副产物是小分子可以透过透析袋，大分子insulin-SH-P不能透过透析袋，通过多次透析的方式可以除去副产物)后获得insulin-SH-P，反应式如下：insulin-SH-P中，insulin表示胰岛素，SH表示活性巯基基团，P表示保护基团，即insulin结构式中，圆形表示胰岛素氨基酸链，n表示胰岛素氨基酸链上氨基的数目，1≤x≤n，x和n均为整数，x优选为1。insulin-SH-P与含EDTA(螯合溶液中的金属离子，除去溶液中金属离子的干扰)和盐酸羟胺的PBS室温反应去掉保护基团，经葡聚糖凝胶柱纯化后形成含活性巯基基团的insuli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于酶联免疫试剂盒的组合物，其特征在于，包括封闭液和酶标稀释液；所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300。

【技术特征摘要】
1.一种用于酶联免疫试剂盒的组合物，其特征在于，包括封闭液和酶标稀释液；所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300。2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述封闭液含有0.6％-1％BSA，0.8％-1.5％的聚乙烯醇、0.8％-1.5％甘露醇、0.05％叠氮钠和0.01M磷酸氢二钠，pH值为7.4，余量为水。3.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1％-3％的聚乙二醇、0.01％的阿拉伯树胶、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300，余量为水。4.权利要求1-3任意一项所述组合物在制备酶联免疫试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒为糖尿病免疫检测试剂盒。6.一种糖尿病抗体谱检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：包被有糖尿病自身抗原的蛋白芯片、用酶标稀释液稀释的酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液；其中，所述蛋白芯片包被糖尿病自身抗原后采用封闭液封闭，所述封闭液含有BSA、聚乙烯醇、甘露醇、叠氮钠和磷酸氢二钠，所述酶标稀释液含有Tris、柠檬酸、BSA、聚乙二醇、阿拉伯树胶、甜菜碱和Proclin300。7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述封闭液含有0.6％-1％BSA，0.8％-1.5％的聚乙烯醇、0.8％-1.5％甘露醇、0.05％叠氮钠和0.01M磷酸氢二钠，pH值为7.4，余量为水。8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述酶标稀释液含有0.1M的Tris、0.05M的柠檬酸、2％-3％的BSA、1％-3％的聚乙二醇、0.01％的阿拉伯树胶、0.8％-1.5％的甜菜碱以及0.05％的Proclin300，余量为水。9.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述包被通过亲和素化的蛋白芯片与生物素化的糖尿病自身抗原相互结合包被。10.根据权利要求6或9所述试剂盒，其特征在于，所述糖尿病自身抗原选自IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8、IA中的一种或两种以上。11...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大准，张永顶，马伟民，王洪涛，马新民，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44