通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用技术

本发明专利技术旨在提供一种通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方及菌株及其应用，本发明专利技术采用基因工程手段通过敲除地衣芽孢杆菌DW2的基因组中的lysE基因构建得到地衣芽孢杆菌DW2ΔlysE，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了10%以上。

【技术实现步骤摘要】
通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
本专利技术涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。
技术介绍
杆菌肽是由枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌产生的一种环肽类抗生素。杆菌肽作为一种广谱性抗生素，能有效的抑制革兰氏阳性菌（如梭状芽胞杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等）及部分革兰氏阴性菌（如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌等）。并且，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，且排泄迅速、没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、异亮组氨酸（His）、D-天冬氨酸（D-Asp）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）、D-谷氨酸（D-Glu）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽是以氨基酸为前提物质，通过非核糖体合成酶进行合成的，其合成所需的氨基酸主要来源于培养基中的氮源豆粕和细胞自身合成。目前关于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚，也就是说，赖氨酸是否是杆菌肽合成的限制性氨基酸以及赖氨酸的供给与杆菌肽产量之间的关系均尚无定论；并且，赖氨酸转运蛋白LysE（其合成基因为：lysE基因）在地衣芽胞杆菌中的具体功能也尚不清楚；再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，通过改造地衣芽孢杆菌中的赖氨酸转运蛋白LysE是否能够提高抗菌肽的产量是无法预测到的。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）的方法，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE；（5）将lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lysE基因的上游臂或lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选lysE基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lysE基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE；其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的lysE基因为SEQUENCELISTING中所示。本专利技术人首次尝试构建敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌DW2ΔlysE，得到了大幅提高地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本专利技术构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔlysE的杆菌肽产量提高了10%以上。本专利技术的研究结果表明：敲除氨基酸转运蛋白基因lysE是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。本专利技术的目的之二在于根据上述通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE。本专利技术的目的之三在于根据上述通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH7.0~7.2。所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。附图说明图1为步骤（1）得到的lysE基因的上下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为lysE基因的上游同源臂，泳道3为lysE基因的下游同源臂；图2为步骤（1）得到的融合基因序列A的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为步骤（1）得到的融合基因序列A；图3为步骤（4）得到的敲除质粒T2(2)-ori-lysE进行菌落PCR验证图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为敲除质粒T2(2)-ori-lysE进行菌落PCR验证的条带；图4为步骤（6）得到的敲除lysE基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE菌株的验证条带，泳道1为DNAmarker，泳道2为地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE的PCR验证条带；其中，图1-图2中的DNAmarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE；（5）将lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lysE基因的上游臂或lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选lysE基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lysE基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)‑ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)‑ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)‑ori中，得到lysE基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ lysE；（5）将lysE基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ lysE转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lysE基因的上游臂或lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选lysE基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lysE基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE；其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的lysE基因为SEQUENCE LISTING中所示。...

【技术特征摘要】
1.通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE；（5）将lysE基因敲除质粒T2(2)-ori-lysE转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lysE基因的上游臂或lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选lysE基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，李阳，吴非，李俊辉，楼丽君，陈晓斌，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35