一种基于CRISPR‑Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的制备方法为：将Cas9蛋白表达框和sgRNA scaffold表达框整合在出发载体pHY xyl中，获得pHY‑Cas9‑sgRNA scaffold，然后将以amyL为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条整合到所述的pHY‑Cas9‑sgRNA scaffold中，制得所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体。本发明专利技术可以大幅改善当前地衣芽孢杆菌基因编辑困难的现状，显著提高基因编辑的效率。

A Bacillus licheniformis genome editing vector and its preparation method Cas9 system based on CRISPR

The invention discloses a vector editing of Bacillus licheniformis genomic CRISPR based on Cas9 system, a preparation method for the Bacillus licheniformis genome editing vector: the expression of Cas9 protein and sgRNA expression of scaffold box frame of integration in the vector pHY xyl, pHY Cas9 sgRNA scaffold, then the target site design any more sgRNA fragments in the synthesis of an integrated into the pHY Cas9 sgRNA scaffold amyL, prepared by the Bacillus licheniformis genome editing vector. The present invention can greatly improve the current situation of gene editing difficulties of Bacillus licheniformis and improve the efficiency of gene editing significantly.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法
本专利技术涉及基因
，尤其是涉及一种连入特异性的sgRNA片段的基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体。
技术介绍
地衣芽孢杆菌是一类革兰氏阳性杆菌，它只有单层细胞膜，在干燥、缺乏营养等极端恶劣条件下能生成内生孢子，待条件适合再次恢复生长。地衣芽孢杆菌具有广泛应用的工业微生物。它不仅是大宗的工业酶制剂-淀粉酶和蛋白酶的主要产生菌；同时由于其优异的分泌能力，简单的发酵条件和食品安全的特性，又被用于外源基因的表达宿主，生产多种食品用酶制剂。随着其模式菌株ATCC14580基因组的完全解析，人们对这一类菌株生长及代谢的认识提升到了一个新的层面，进而又为这一工业微生物开拓了新的应用。当前以基因组序列信息为蓝图，基于人工设计的遗传扰动而进行的代谢工程已成为研究地衣芽孢杆菌复杂的代谢途径以及进行菌种改造构建需要表型的最有效策略。人们为编辑细菌基因组而开发出的绝大多数遗传改造工具对于地衣芽孢杆菌的遗传操作都被证明行之有效，然而仍存在一些局限性影响了这些工具在地衣芽孢杆菌这一特殊宿主中应用效率的提高。比如，除了传统的使用PCR片段(突变盒)介导的同源整合双交换法进行基因编辑以外，还一种基于基因组等位替换(allelicexchange)的基因敲除方法，该方法的最大特点是目的基因的敲除和整合是在一个反向选择标记-mazF的辅助下完成的。mazF基因在大肠杆菌中的诱导表达可致死细胞从而进行筛选，该方法较抗生素标记辅助的筛选灵敏度和准确度均大为提高。然而，这一系统在操作过程中仍然依赖抗生素标记实现整合突变盒的筛选；尽管理论上可使用FLP重组酶在后续实验中删除该抗生素标记，仍将在基因组上留下明显的“伤疤”。此外，FLP重组酶的功能在不同宿主中差异显著，极大地限制了这一基因编辑方法的通用性。规律成簇间隔短回文重复(theClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)以及CRISPR介导的基因剪切系统(CRISPR-associated,Cas)是一类在细菌和古细菌中普遍存在的免疫系统，它可以高效识别并切割进入细胞的诸如噬菌体或质粒等外源DNA。它的作用方式如下：位于CRISPR回文重复之间的短DNA序列组成了目的基因的CRISPR阵列(CRISPRarray)，这一阵列在重复序列之间被转录及加工，形成CRISPR-RNA(crRNA)。然后crRNA引导着Cas核酸酶定位到目标位点，在特异性的PAM(Protospacer-adjacentMotif)序列的辅助下完成对目标序列的剪切。来自于化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的天然CRISPR/Cas9系统包含了由crRNA和反式调控激活crRNA(tracrRNA)构成的双RNA复合体，这一复合体可介导Cas9核酸内切酶的作用，这一系统是人们研究最早的CRISPR/Cas9系统之一。最近，该系统已被成功应用于多种微生物的基因编辑，包括革兰氏阴性菌的大肠杆菌以及革兰氏阳性菌的S.pneumonia和Lactobacillusreuteri，结果均表明这一系统可实现对细菌基因组快速，方便地定向修饰。但是，当前基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑系统尚未构建，使得这一先进技术无法在地衣芽孢杆菌这一重要工业微生物中得以发挥。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法。本专利技术可以大幅改善当前地衣芽孢杆菌基因编辑困难的现状，显著提高基因编辑的效率。本专利技术的技术方案如下：一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的制备方法为：将Cas9蛋白表达框和sgRNAscaffold表达框整合在出发载体pHYxyl中，获得pHY-Cas9-sgRNAscaffold，然后将以amyL为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条整合到所述的pHY-Cas9-sgRNAscaffold中，制得所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体。所述Cas9蛋白表达框包括Pxyl启动子，Cas9蛋白及amyL终止子。所述Cas9蛋白表达框的序列如SEQIDNO.1所示。所述gRNAscaffold表达框包括PHpaII启动子和sgRNAscaffold。所述gRNAscaffold表达框的序列如SEQIDNO.2所示。所述sgRNA片段的序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示。所述出发载体pHY-xyl的序列如SEQIDNO.9所示。一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)设计并合成符合地衣芽孢杆菌密码子特性的Cas9蛋白表达框、sgRNAscaffold表达框和多条sgRNA片段；根据地衣芽孢杆菌的密码子偏好性优化Cas9蛋白的编码基因并进行体外合成，依据目标基因amyL表达框内部的合适靶点合成sgRNAscaffold表达框和多条sgRNA片段；(2)将Cas9蛋白表达框克隆到经酶切的出发载体pHYxyl中，获得pHY-Cas9；将步骤(1)中的密码子偏好性优化的Cas9蛋白编码基因克隆到出发载体pHY-xyl中，获得pHY-Cas9，使Cas9蛋白编码基因在木糖诱导启动子的介导下表达；(3)将sgRNAscaffold表达框克隆到步骤(2)制得的pHY-Cas9中，获得pHY-Cas9-sgRNAscaffold；以pMA5质粒为模板，使用引物扩增获得启动子，扩增产物酶切后插入质粒pHY-Cas9，再将步骤(1)中合成的sgRNAscaffold表达框经酶切后连接入上述质粒的相应位点，获得pHY-Cas9-sgRNAscaffold；(4)将以amyL为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条克隆到pHY-Cas9-sgRNAscaffold中，再连接入基因编辑修复序列，获得所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体；提取地衣芽孢杆菌基因组DNA，使用DNA聚合酶及引物扩增获得目的基因部分开放阅读框truncamyL，扩增产物纯化后T-A克隆至pMD18-T-simple载体，再使用引以质粒pMA5为模板扩增新霉素抗性基因片段，以上质粒及片段均使用限制性内切酶消化并连接，得到重组质粒，为核酸酶剪切位点提供修复元件，酶切以上质粒，胶回收包含修复序列及抗生素标记的片段，将该片段连入步骤(3)中的pHY-Cas9-sgRNAscaffold，完成地衣芽孢杆菌淀粉酶编码基因编辑质粒的构建。一种含有所述基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑系统，所述地衣芽孢杆菌基因组编辑系统的制备方法为：将基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体电转化至电转化感应态地衣芽孢杆菌细胞中，然后进行培养得到所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑系统。所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPR‑Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的制备方法为：将Cas9蛋白表达框和sgRNA scaffold表达框整合在出发载体pHY xyl中，获得pHY‑Cas9‑sgRNA scaffold，然后将以amyL为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条整合到所述的pHY‑Cas9‑sgRNA scaffold中，制得所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体的制备方法为：将Cas9蛋白表达框和sgRNAscaffold表达框整合在出发载体pHYxyl中，获得pHY-Cas9-sgRNAscaffold，然后将以amyL为靶位点设计合成的多条sgRNA片段中的任意一条整合到所述的pHY-Cas9-sgRNAscaffold中，制得所述地衣芽孢杆菌基因组编辑载体。2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述Cas9蛋白表达框包括Pxyl启动子，Cas9蛋白及amyL终止子。3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述Cas9蛋白表达框的序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述gRNAscaffold表达框包括PHpaII启动子和sgRNAscaffold。5.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述gRNAscaffold表达框的序列如SEQIDNO.2所示。6.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体，其特征在于所述sgRNA片段的序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，李由然，张梁，丁重阳，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32