The invention provides a method for separating and purifying exosomes from semen. Compared with the conventional method for separating and extracting exosomes, the invention cuts down the low-speed centrifugal steps of 300g and 2000g, avoids the exosomes being brought into the cell precipitation of the next centrifugal step by viscous substances as far as possible, and reduces the loss of exosomes. The two step dilution method reduces the loss of exocrine and improves its purity. Using 8%PEG6000 for overnight treatment, the purity of exocrine body was further improved. The PBS used was filtered by 0.1 M filter to reduce the introduction of foreign impurities. Two step filtration method (0.22 M filter filtration process) was adopted to reduce the larger particle size mixing. By this method, the exudate of semen source with higher quality and better compliance with experimental requirements can be obtained. On the premise of keeping the quality and quantity of exudate from semen, the purity is maximally improved.
【技术实现步骤摘要】
一种从精液中分离提纯外泌体的方法
本专利技术涉及一种从精液中分离提纯外泌体的方法。
技术介绍
差速离心是目前用于分离细胞上清或体液来源的外泌体最常见技术之一,该方法包括以下几个步骤:低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片;高速离心以消除大囊泡;高速离心以沉淀外泌体。来源于Beckman公司的外泌体提取流程如图1所示。生物体液的粘度与分离的外泌体的纯度有显著的相关性,而且,高粘度的生物样本需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。但是,更长的的超速离心步骤容易损耗外泌体的总量,更高的离心速度容易破坏外泌体的正常形态。而常规的外泌体提取流程则无法得到纯度符合要求的外泌体。因此,对于粘度较高的生物体液,比如精液,现有的外泌体分离方法不能很好的满足相关实验要求,目前迫切需要一种即能保质又能保量的外泌体分离提纯方法。
技术实现思路
针对精液等粘度较高的生物体液,现有的外泌体分离方法提取时精液来源外泌体时出现的总量耗损和纯度不高的技术问题,本专利技术提供了一种从精液中分离提纯外泌体的方法,通过该方法可以获得质量较高且纯度更加符合实验要求的精液来源外泌体。为实现上述目的,本专利技术所采取的技术方案:一种从精液中分离提纯外泌体的方法,包括以下步骤:(1)采用PBS对精液样本进行稀释;此步是为了使精液原液中粘稠成分得到初步稀释,尽量避免外泌体被带入下一步离心的细胞沉淀中,减少外泌体的损失。(2)将步骤(1)中稀释后的精液样本,在4℃条件下以4000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀;以去除细胞和死细胞。(3)将步骤(2)得到的上清液在4℃条件下以12000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀 ...
【技术保护点】
1.一种从精液中分离提纯外泌体的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)采用PBS对精液样本进行稀释;(2)将步骤(1)中稀释后的精液样本,在4℃条件下以4000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀;(3)将步骤(2)得到的上清液在4℃条件下以12000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀;(4)将步骤(3)得到的上清液用PBS稀释;(5)将步骤(4)稀释后的上清液用0.22μm滤器过滤处理;(6)将步骤(5)得到的上清液与PEG6000充分混合,使PEG6000终浓度为8wt%,再4℃过夜;(7)4℃过夜后,将步骤(6)得到的混合物在4℃条件下以12000g的转速离心,留取沉淀,弃上清;(8)将步骤(7)得到的沉淀用PBS重悬,在4℃条件下以100000g的转速离心;离心结束后,弃上清,留取沉淀;再将沉淀用PBS重悬,4℃条件下放置;(9)将步骤(8)得到的重悬液在4℃条件下以100000g的转速离心70分钟;离心结束后,弃上清,留取沉淀,该沉淀即为分离提纯所得的精液来源外泌体。
【技术特征摘要】
1.一种从精液中分离提纯外泌体的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)采用PBS对精液样本进行稀释;(2)将步骤(1)中稀释后的精液样本,在4℃条件下以4000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀;(3)将步骤(2)得到的上清液在4℃条件下以12000g的转速离心,留取上清液,弃沉淀;(4)将步骤(3)得到的上清液用PBS稀释;(5)将步骤(4)稀释后的上清液用0.22μm滤器过滤处理;(6)将步骤(5)得到的上清液与PEG6000充分混合,使PEG6000终浓度为8wt%,再4℃过夜;(7)4℃过夜后,将步骤(6)得到的混合物在4℃条件下以12000g的转速离心,留取沉淀,弃上清;(8)将步骤(7)得到的沉淀用PBS重悬,在4℃条件下以100000g的转速离心;离心结束后,弃上清,留取沉淀;再将沉淀用PBS重悬,4℃条件下放置;(9)将步骤(8)得到的重悬液在4℃条件下以100000g的转速离心70分钟;离心结束后,弃上清,...
【专利技术属性】
技术研发人员:邓春华,刘贵华,谢云,张弛,吕林艳,邓存灿,
申请(专利权)人:中山大学附属第一医院,中山大学附属第六医院,
类型:发明
国别省市:广东,44
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