抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。候选的RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBY，分别命名为SKLPBY1‑SKLPBY5，目的RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBT，分别命名为SKLPBT1‑SKLPBT5。本发明专利技术的RNA适配体能特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒的感染效率，可用作丝状病毒感染的诊断试剂以及抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体及其应用
本专利技术属于生物学领域中的核糖核苷酸(RNA)及其序列与结构，特别是涉及一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体及其序列、结构与其在制备丝状病毒感染的诊断试剂和治疗药物中的应用。
技术介绍
丝状病毒(Filovirus)为单链负链RNA病毒，属于丝状病毒科(Filoviridae)，包括埃博拉病毒(Ebolavirus)、马尔堡病毒(Marburgvirus)和奎瓦病毒(Cuevavirus)。埃博拉病毒和马尔堡病毒是可引发危害公共安全和人类健康的重大烈性传染病，被列为A类生化武器。埃博拉病毒和马尔堡病毒可造成高致死率出血热的爆发，至今还未有针对这两种病毒有效的抗病毒治疗方法和疫苗。其中，埃博拉病毒是流行程度最广的丝状病毒，可通过体液接触或飞沫等途径在人群中传播，致死率25％-90％。自1976年首次在非洲扎伊尔和苏丹出现至今，埃博拉病毒病已出现十余次有规模的爆发流行，2014年3月在西非爆发的新一轮埃博拉疫情是迄今为止最严重的一次。埃博拉病毒病的临床表现为高热、头痛、肌痛、多器官出血衰竭，目前尚无疫苗、药物上市，研发抗埃博拉病毒药物迫在眉睫。埃博拉病毒有囊膜，表面有包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，GP是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白，中心为螺旋状核衣壳，包括基因组RNA及其它6种病毒蛋白。目前已确定5种亚型，分别为扎伊尔型(Zaire-EBOV)、苏丹型(Sudan-EBOV)、莱斯顿型(Reston-EBOV)、科特迪瓦泰森林型(Forest-EBOV)和乌干达本迪布焦型(Bundibugyo-EBOV)，其中扎伊尔型恶性程度最强，死亡率50％-90％，苏丹型恶性程度次之，死亡率50％-70％。引起2014年埃博拉病毒病的病毒隶属于扎伊尔亚型。1976至2014年，不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列间的同源性为54％-65％，同亚型包膜糖蛋白氨基酸序列同源性为95％-100％。2014年在不同地域分离到的同亚型埃博拉病毒的包膜糖蛋白氨基酸序列并不完全一致，但是差异很小，同源性达到了99.7％-100％。2014年来自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸同源性达到了100％，但是来自几内亚的三条扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白氨基酸序列有一定差异。不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白分别在进化树的不同分支上：2014年分离自塞拉利昂的扎伊尔-埃博拉病毒包膜糖蛋白在一大分支上；1976至2014年分离自塞拉利昂以外国家的扎伊尔-埃博拉病毒糖蛋白在另一个大分支上。核酸适体是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子，包括DNA适体和RNA适体。RNAs的特征在于它们能够釆用复杂而稳定的结构，特异地并且容易地结合目标蛋白，并且可以轻松地化学合成，使RNAs潜在地成为非常有用的诊断和/或治疗先导化合物。短RNA配体，称为RNA适体，采用被称为指数富集的配体系统进化(SELEX)的体外反复筛选技术，利用高亲和性和特异性结合到多种蛋白，从一个随机RNA文库中鉴别出来。适体是分子量约为20-50个碱基的寡核苷酸，与蛋白质或小分子物质能够特异性结合并有较高的亲和力。适体不具有免疫源性或低免疫源性，可通过化学修饰的方法增加其稳定性并增大其在体内的半衰期。一些适体已成功地用动物疾病模型进行评估，其中一些目前正处于治疗的临床开发阶段。值得注意的是，美国FDA最近批准了抑制抗血管内皮生长因子(VEGF)的RNA适配体，称为哌加他尼钠(Macugen)，用于治疗各种类型的新生血管性老年性黄斑变性，表明RNA适配体具有巨大的治疗潜力。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。本专利技术所提供的抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，是能够特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒感染的RNA适配体，候选RNA适配体统称为SEQIDSKLPBY，其为包含核苷酸序列如序列表中SEQNO.1(SKLPBY1)或SEQNO.2(SKLPBY2)或SEQNO.3(SKLPBY3)或SEQNO.4(SKLPBY4)或SEQNO.5(SKLPBY5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。进一步，所述的RNA适配体是用氟基团取代SEQIDSKLPBY中U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基而得到的目的适配体，统称为SEQIDSKLPBT，SEQIDSKLPBT为核苷酸序列如序列表中SEQNO.6(SKLPBT1)或SEQNO.7(SKLPBT2)或SEQNO.8(SKLPBT3)或SEQNO.9(SKLPBT4)或SEQNO.10(SKLPBT5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。氟基团是指-F，用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基的目的是降低RNA水解酶对RNA的降解。更进一步，所述的RNA适配体，为将所述目的适配体SEQIDSKLPBT进一步用胆固醇基标记5'末端，用idT(反脱氧胸苷)标记3'末端得到的RNA适配体。胆固醇基是指对胆固醇进行的分子修饰，用胆固醇基标记5'末端的目的是增加RNA分子的脂溶性，以通过细胞膜。idT(反脱氧胸苷)是指反脱氧胸苷，其结构如下，用idT(反脱氧胸苷)标记3'末端的目的是保护RNA免受核酸酶的降解。再进一步，所述的RNA适配体，为在所述目的适配体SEQIDSKLPBT的5’末端进一步添加磷酸基团修饰键(保护RNA免受核酸酶的降解)或PEG(聚乙二醇)标签(延长适体在体内的半衰期)得到的RNA适配体。可以使RNA适配体能够抵抗核酸酶并且可以通过细胞膜，增加其稳定性和半衰期。所述丝状病毒包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。本专利技术RNA适配体中所述RNA分子可通过化学方法合成。本专利技术的第二个目的是提供一种用于诊断丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的试剂盒。本专利技术所提供的用于诊断丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的试剂盒，包含上述可以抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体。通过探测RNA适配体是否与丝状病毒的包膜糖蛋白特异性结合实施诊断。本专利技术的第三个目的是提供一种丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抑制剂。本专利技术所提供的丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抑制剂，其主要成分为所述的抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体。该RNA适配体可以特异性地结合丝状病毒糖蛋白胞外部分卷曲螺旋区域的碳端，通过抑制丝状病毒与细胞膜的融合过程，达到抑制丝状病毒进入受体细胞的目的。本专利技术提供了一种可以抑制丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)感染的抗病毒包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的RNA适配体。基于系统与合成生物学方法，专利技术人以丝状病毒包膜糖蛋白为靶点，通过人工设计与计算得到能够与其特异性结合的RNA适配体序列与结构，具体方法：从随机核苷酸序列的组合RNA文库中，釆用系统合成生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，是能够特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒感染的RNA适配体，候选RNA适配体统称为SEQ ID SKLPBY，为以下SKLPBY1至SKLPBY5之一：SKLPBY1：CSUUDCCCGGAAMGBGAUCSG，SKLPBY2：CGKAGAMCAURUVACG，SKLPBY3：GCRAGUUMGCUUDUCAYGC，SKLPBY4：VUUAMACKUARUC，SKLPBY5：MUAUCRGUS；所述U包括但不限于A。

【技术特征摘要】
1.抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的RNA适配体，是能够特异性地结合丝状病毒包膜糖蛋白并抑制丝状病毒感染的RNA适配体，候选RNA适配体统称为SEQIDSKLPBY，为以下SKLPBY1至SKLPBY5之一：SKLPBY1：CSUUDCCCGGAAMGBGAUCSG，SKLPBY2：CGKAGAMCAURUVACG，SKLPBY3：GCRAGUUMGCUUDUCAYGC，SKLPBY4：VUUAMACKUARUC，SKLPBY5：MUAUCRGUS；所述U包括但不限于A。2.根据权利要求1所述的RNA适配体，其特征在于：其为包含如序列表中SEQNO.1(SKLPBY1)或SEQNO.2(SKLPBY2)或SEQNO.3(SKLPBY3)或SEQNO.4(SKLPBY4)或SEQNO.5(SKLPBY5)所示的RNA分子，或与序列表具有至少90％同源性的核苷酸序列的RNA分子。3.根据权利要求1或2所述的RNA适配体，其特征在于：所述RNA适配体用氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2'-羟基，得到的目的适配体统称为SEQIDSKLPBT，为以下SKLPBT1至SKLPBT5之一:SKLPBT1：CASUUGSCCGGAAMGBGAUCSUG，SKLPBT2：CGKGGAMCAURUGACMCG，SKLPBT3：GCGCRAGUUMGCUUAKUCMUSGC，SKLPBT4：YUAMACKUAR，SKLPBT5：CMUWCAGKGCS；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕越，童贻刚，刘书霞，米志强，安小平，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11