一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切；本发明专利技术还公开了一种包含本发明专利技术RNA传感器的试剂盒及检测硫胺素焦磷酸的方法；本发明专利技术的RNA传感器检测硫胺素焦磷酸灵敏度高、能够对硫胺素焦磷酸进行定性和定量检测。

A RNA sensor for detecting thiamine pyrophosphate and its application

The present invention discloses a RNA sensor for detecting thiamine pyrophosphoric acid, including RNA aptamers of specific thiamine pyrophosphoric acid, connection segment RNA and hammerhead ribozyme, in which RNA aptamers are connected through the joint segment RNA with the hammerhead ribozyme, and when the RNA aptamers are induced to thiamine pyrophosphate, the self shearing of the hammerhead ribozyme is triggered. The invention also discloses a kit containing the RNA sensor of the invention and a method for detecting thiamine pyrophosphoric acid; the RNA sensor of the invention has high sensitivity for detecting thiamine pyrophosphoric acid, and can be used for qualitative and quantitative detection of thiamine pyrophosphoric acid.

【技术实现步骤摘要】
一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种快速、灵敏检测硫胺素焦磷酸(TPP)的RNA传感器及其应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是一种神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD最突出的病理特征包括脑内β-淀粉样蛋白沉积、tau样蛋白过度磷酸化、脑内葡萄糖代谢紊乱、神经元及其突触丢失。TPP是葡萄糖代谢途径中丙酮酸脱氢酶复合体，α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及磷酸戊糖途径中转酮醇酶的辅酶因子。TPP缺乏会导致以上三种酶类的活性下降、三梭酸循环发生障碍、三磷酸腺苷产生受阻。进一步研究发现，TPP缺乏还会产生大量的活性氧，导致了氧化应激的发生。因此TPP的缺乏与AD的发生和发展密切相关，有望成为AD早期诊断标准物。目前用于TPP检测的方法主要有荧光法，电化学法，化学发光法，细胞内荧光生物传感器，基于液相色谱-质谱联用的检测方法以及基于纳米金的检测方法等。虽然用于检测TPP的方法种类繁多，但都存在一定的局限和缺点。例如基于液相色谱-质谱联用的检测方法，虽然该技术检测结果较精准，可重复性强，但它需要专业的操作，且设备精良昂贵，最重要的是不能实现临床上的高通量检测。而细胞内荧光生物传感器虽然利用了核糖开关的原理，特异性较好，但操作要求高且较为繁琐，此外这种方法对本底的浓度水平要求较高(微摩尔/升，umol/L)，因此该方法不适合应用到人体生物样本内TPP含量(如血液中：纳摩尔/升，nmol/L)的检测。基于纳米金的检测方法可以达到较低的检出限，但这种检测方法的特异性不高，例如通过静电作用结合其他小分子，造成假阳性信号。基于电化学法和化学发光法的检测手段，虽然较为方便，快速，但均存在对TPP识别特异性不高的缺点。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供了能够便捷、灵敏地检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用。在本专利技术的第一个方面中，提供了一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切。优选地，所述连接段RNA由两条RNA序列组成。优选地，所述两条RNA序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；优选地，所述两条RNA序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；优选地，所述特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体来源于大肠杆菌；所述的硫胺素焦磷酸适配体结合硫胺素焦磷酸的KD值(分离常数：衡量分子间结合力强弱，数值越小结合力越强)在60nmol/L左右，并且可以很好的区分硫胺素焦磷酸类似物硫胺素(T)和硫胺素单磷酸(TMP)以及其它所有的代谢小分子(至少三个数量级的区分度)。硫胺素焦磷酸适配体的超高灵敏度和超强特异性决定了本专利技术中的硫胺素焦磷酸检测系统可直接应用于检测未经纯化分离的生物样本中的硫胺素焦磷酸含量，如人体外周血等。优选地，本专利技术的RNA传感器核酸序列如SEQIDNO:5所示；优选地，本专利技术的RNA传感器核酸序列如SEQIDNO:6所示；在本专利技术的第二个方面中，提供了一种测量硫胺素焦磷酸的方法，包括使用本专利技术所述的RNA传感器。优选地，所述测量硫胺素焦磷酸的方法包括以下步骤：a.将本专利技术的RNA传感器与待测样品接触；b.检测RNA传感器自切产生的RNA片段。优选地，待测样品为血液样品。优选地，所述步骤b是通过链置换等温扩增反应及化学发光技术检测RNA传感器自切产生的RNA片段。优选地，步骤b包括：b1.加入第一扩增序列、第二扩增序列、T4多聚核苷酸激酶、BsmDNA聚合酶和Nb.BbvCl切口酶进行扩增反应，其中第一扩增序列如SEQIDNO：7所示，第二扩增序列如SEQIDNO：8所示；b2.检测反应生成的G-四联体结构。优选的，步骤b2包括：加入H2O2与ABTS2-进行显色反应。优选的步骤b2包括：在波长414nm处检测反应生成的G-四联体含量，将检测结果与硫胺素焦磷酸浓度和G-四联体量之间的对应曲线比对，确定硫胺素焦磷酸含量。本专利技术的链置换等温扩增反应是现有技术的改进，改进的链置换等温扩增技术可以将微弱的RNA切割信号放大，进一步提高检出限；链置换等温扩增过程中工具酶的工作温度在37℃，所有操作可在简单的恒温设备中进行，对设备要求很低。改进的链置换等温扩增技术与筛选得到的RNA传感器和化学发光技术结合，放大RNA切割信号，实现对硫胺素焦磷酸的可视化检测：RNA传感器特异感应硫胺素焦磷酸会触发自切割，产生一个RNA小片段，其可以作为一个引发物在BsmDNA聚合酶和Nb.BbvC1切口酶的作用下引发下游一系列扩增反应，生成大量含有特定功能的G-四联体结构。G-四联体的生成量与硫胺素焦磷酸的量呈正相关关系，本专利技术还建立了硫胺素焦磷酸浓度与G-四联体量之间的对应曲线。这些G-四联体还可与Hemin(氯化血红素)结合，催化H2O2(过氧化氢)与ABTS2-(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)反应，产生呈绿色的生成物ABTS-。从而可以实现，一方面能通过可视化观察实现对硫胺素焦磷酸的定性检测，另一方面可通过在波长414nm处检测G-四联体含量间接实现对硫胺素焦磷酸的定量检测。本专利技术对生物样本使用量要求低(几十微升)，检测周期用时短(2-3小时)，整个反应可在一个试管内自发进行，操作简便且不易受污染影响。在临床检测中，硫胺素焦磷酸的不稳定性决定了大量样本采集后需立即快速处理检测，本专利技术易于实现高通量快速检测，可很好的解决这一临床难题，为阿尔兹海默病的早期诊断提高一个有力的手段。在本专利技术的第三个方面中，提供了RNA传感器在制备用于诊断阿尔茨海默病的诊断工具中的应用。在本专利技术的第四个方面中，提供了一种检测试剂盒，包含本专利技术所述的RNA传感器。本专利技术的RNA传感器的筛选方法包括，特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体通过一段随机序列与锤头状核酶连接起来，生成一个初代的RNA序列库。利用指数富集的配体系统进化技术，从初代库中筛选获得可特异感应硫胺素焦磷酸从而触发核酶自切割反应的联动型RNA序列。优选地，在筛选过程中，通过逐步减少允许核酶自切反应的时间，以及降低硫胺素焦磷酸浓度等手段施加压力，在试管内进化获得灵敏度高、特异性强的RNA传感器。进一步优选地，所述指数富集的配基系统进化技术的条件包括：循环次数包括12次；RNA自切酶反应的时间在第1-5轮循环为10分钟、第6-11轮循环为5分钟、第12轮循环为1分钟；和/或，硫胺素焦磷酸浓度在第1-4轮循环为200mM，第5-8轮循环为20mM、第9-11轮循环为2mM和第12轮循环为0.2mM。优选的，本专利技术的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器的序列如SEQIDNO:5所示。优选的，本专利技术的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器的序列如SEQIDNO:6所示。本专利技术所述的RNA传感器和检测方法还可以用于非诊断目的硫胺素焦磷酸检测。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下优点：1、本专利技术的RNA传感器检测硫胺素焦磷酸方便且灵敏度高；2、本专利技术不仅可以利用RNA传感器本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切。

【技术特征摘要】
1.一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切。2.如权利要求1所述的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述连接段RNA由两条RNA序列组成。3.如权利要求2所述的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述两条RNA序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。4.如权利要求2所述的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述两条RNA序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。5.如权利要求1所述的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体来源于大肠杆菌中的核糖开关。6.如权利要求1所述的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述RNA传感器的序列为SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。7.一种检测硫胺素焦磷酸的方法，其特征在于，使用权利要求1-6任意一项所述的RNA传感器。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：a.将权...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾宏周，杜鑫雨，钟春玖，程小芹，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31