【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及基于raa-crispr-cas13a试纸检测人腺病毒b亚属dna的试剂盒。
技术介绍
1、人腺病毒(human adenovirus，hadv)是无包膜的双链dna病毒，有多种型别，分为7个亚属(a～g)，可引发多种疾病，主要包括呼吸道感染、眼结膜炎和胃肠道疾病等。其中b，c，e亚属可引起呼吸道感染。低龄儿童，免疫低下人群等易感人群在呼吸道感染人腺病毒后可能会引起重症肺炎，死亡率较高，严重危害生命健康。有研究显示，腺病毒肺炎在免疫缺陷患者中的致死率高达50％。人腺病毒b亚属在儿童和成人中可导致更显著的发病率、更严重的呼吸系统疾病甚至致命感染。因此，对人腺病毒b亚属进行及时准确的检测具有重要的临床意义。目前对于人腺病毒的检测方法主要针对其抗原和核酸，例如酶联免疫吸附法、荧光定量pcr法。这些方法对人腺病毒临床样本的检测灵敏度和特异性不高，并且一致性较差，需要更精准的检测方法。
2、近年来，基于crispr-cas技术的检测方法快速发展，在生物、医学、农牧业等方面得到广泛应用。cas13a是一个rna引导的crispr效应蛋白，它能够特异性靶向切割单链rna，并在切割后仍保持活性，继续切割其他非靶标rna，这种特性被称为“附带切割”，结合等温扩增技术，该方法在检测病毒、细菌等多种病原体时表现出高灵敏与高特异性。
技术实现思路
1、基于现有技术存在的技术问题，本专利技术提供一种基于raa-crispr-cas13a试纸检测人
2、依据本专利技术技术方案的第一方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物包括raa引物对，所述raa引物对由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的人腺病毒b亚属dna片段的引物组成。
3、进一步地，所述的组合物中，所述raa引物对由核苷酸序列是seq id no.4和seqid no.8的两条单链dna组成。
4、进一步地，所述组合物还包括crrna，所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向人腺病毒b亚属dna靶点序列的向导序列。
5、进一步地，所述的组合物中，所述crrna中的所述锚定序列为seq id no.13的第1-38位，所述向导序列为seq id no.13的第39-66位。
6、进一步地，所述的组合物中，所述crrna的核苷酸序列是seq id no.13。
7、依据本专利技术技术方案的第二方面，本专利技术提供用于检测人腺病毒b亚属dna的试剂盒，其所述试剂盒包括上述组合物。
8、进一步地，所述试剂盒还包括cas13a蛋白。
9、进一步地，所述的试剂盒中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。
10、进一步地，所述的试剂盒中，所述lwcas13a蛋白购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
11、进一步的，所述试剂盒还包括用于检测扩增产物的如下试剂中的全部或部分：ntp(如ntp mix)、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、报告rna(报告rna是具有信号报告功能的rna分子，其由20个u组成，报告rna的序列两端分别标记fam和生物素)、rnase free water。
12、进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增人腺病毒b亚属dna靶点序列的缓冲液和/或ddh2o。
13、所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗fitc抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；
14、所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔igg。
15、依据本专利技术技术方案的第三方面，本专利技术提供如下任一物质：
16、a1、上述组合物中所述的raa引物对；
17、a2、上述组合物中所述的crrna；
18、a3、a2所述的crrna和cas蛋白，或者二者形成的复合体。
19、进一步地，上述的物质中，所述cas蛋白为cas13a蛋白。
20、进一步地，上述的物质中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。
21、依据本专利技术技术方案的第四方面，本专利技术提供上述的组合物或/和上述的物质在如下任一项中的应用：
22、b1、制备用于检测人腺病毒b亚属dna或检测人腺病毒b亚属dna的产品；
23、b2、制备用于检测或辅助检测待测样本中是否含有人腺病毒b亚属dna或制备检测或辅助检测待测样本中是否含有人腺病毒b亚属dna的产品；
24、b3、制备用于筛查目标个体是否携带人腺病毒b亚属或筛查目标个体是否携带人腺病毒b亚属的产品；
25、b4、制备用于诊断人腺病毒b亚属感染或诊断人腺病毒b亚属感染的产品；
26、b5、制备用于筛选或辅助筛选人腺病毒b亚属防治药物或筛选或辅助筛选防人腺病毒b亚属治药物的产品。
27、依据本专利技术技术方案的第五方面，本专利技术提供一种检测或辅助检测人腺病毒b亚属dna的方法，所述方法为非诊断目的的，所述方法包括使用上述的组合物或上的试剂盒检测待测样本是否为或候选为人腺病毒b亚属，或/和使用上述的组合物或上述的试剂盒检测待测样本是否含有或候选含有人腺病毒b亚属。
28、进一步地，所述的方法包括下述步骤：
29、c1)提取待测样本的核酸为模板，先逆转录为cdna，再采用核苷酸序列是seq idno:4和seq id no:8的单链dna组成的引物对进行raa扩增，得到扩增产物；
30、c2)取c1)所得扩增产物作为模板，配制crispr-cas13a试纸检测体系进行反应，所述crispr-cas13a试纸检测体系包括上述组合物、cas13a蛋白、ntp、t7rna聚合酶、rna酶抑制剂、报告rna；同时以水替代所述raa产物作为阴性对照；将所述体系进行检测，读取检测信号。
31、c3)若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有人腺病毒b亚属；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有人腺病毒b亚属
32、进一步地，步骤c1)中，所述raa扩增的反应条件为：39℃反应30分钟(如30min)。
33、进一步的，步骤c2)中，所述crispr-cas13a检测体系包括所述raa产物、上述任一所述的cas13a蛋白、上述任一所述的crrna、ntp、rna酶抑制剂、t7rna聚合酶、报告rna。
34、进一步的，步骤c2)中，所述反应的条件为：37℃，反应30分钟。
35、更进一步地，所述待测样本可为咽拭子等。
36、本专利技术所提供的检测或辅助检测人腺病毒b亚属dna的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。
37、本专利技术取得的有益技术效果如下：
38、本专利技术基于crispr-cas13a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括RAA引物对，所述RAA引物对由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的人腺病毒B亚属DNA片段的引物组成，以及用于检测人腺病毒B亚属的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述RAA引物对由核苷酸序列是SEQ IDNo.4和SEQ ID No.8的两条单链DNA组成。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括crRNA，所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向人腺病毒B亚属DNA靶点序列的向导序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述crRNA中，所述锚定序列为SEQ IDNo.13的第1-38位，所述向导序列为SEQ ID No.13的第39-66位。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列是SEQ IDNo.13。
6.用于检测人腺病毒B亚属DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括如下任一物质：
8.所述检测方法包括如下步骤:
9.权利要求1-4中任一项所述的组合物或/和权利要求7所述的物质在如下任一项中的应用：
10.一种检测或辅助检测人腺病毒B亚属DNA的方法，所述方法为非诊断目的的，所述方法包括使用权利要求1-5中任一所述的组合物或权利要求6或7所述的试剂盒检测待测样本是否为或候选为人腺病毒B亚属，或/和使用权利要求1-5中任一所述的组合物或权利要求6或7所述的试剂盒检测待测样本是否含有或候选含有人腺病毒B亚属。
...【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括raa引物对，所述raa引物对由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的人腺病毒b亚属dna片段的引物组成，以及用于检测人腺病毒b亚属的crispr-cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述raa引物对由核苷酸序列是seq idno.4和seq id no.8的两条单链dna组成。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括crrna，所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向人腺病毒b亚属dna靶点序列的向导序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述crrna中，所述锚定序列为seq idno.13的第1-38位，所述向导序列为seq id no.13的第39-66位。
...【专利技术属性】
技术研发人员：韩尧，李浩，姜雅轩，孙岩松，王菁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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