【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品配料合成生物学中一种从头高效合成二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌构建及应用。
技术介绍
1、人乳寡糖(human milk oligosaccharide，hmos)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，其中含量最高的是岩藻糖基化人乳寡糖。岩藻糖基化人乳寡糖在促进婴幼儿的大脑发育和维持肠道菌群健康等方面发挥着重要作用。目前，美国、欧盟和澳大利亚等先后批准了几种岩藻糖基化人乳寡糖作为新食品原料使用，包括2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-fl)、3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-fl)和二岩藻糖基乳糖(difucosyllactose,dfl)。与2'-fl和3-fl相比，dfl具有独特的功能，如dfl对无乳链球菌(streptococcus agalactiae)等b组链球菌具有很强的抗菌活性，无乳链球菌是新生儿败血症的主要原因，占全球死产的12％(nan c,et al.2015.“maternal group bstreptococcus-related stillbirth:a systematic review”.brit.j.obstet.gynaec.122:1437-1445.)。近年来，随着合成生物学相关技术的快速发展，微生物合成法已成为合成岩藻糖基化人乳寡糖的主流方法。
2、微生物合成2'-fl和3-fl已有许多报道。在已知合成通路中，gdp-l-岩藻糖是合成2'-fl和3-fl的关键前体物质，其在α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,
3、dfl的合成过程如下，α-1,3/4-岩藻糖基转移酶将gdp-l-岩藻糖转到2'-fl上，得到dfl(yu h,et al.2017.“h.pyloriα1–3/4-fucosyltransferase(hp3/4ft)-catalyzedone-pot multienzyme(opme)synthesis of lewis antigens and human milkfucosides”.chem.commun.53:11012-11015.)。此外，在α-1,2-岩藻糖基转移酶生产2'-fl的过程中，同时会合成少量的dfl(lee h j,et al.2022.“simultaneous productionof2'-fucosyllactose and difucosyllactose by engineered escherichia coli withhigh secretion efficiency”.biotechnol.j.17:2100629)。迄今仅有少数研究报道了dfl的微生物合成，且利用价格高昂的岩藻糖为底物，产量也较低，仅为5.1g/l(zhang a,etal.2021.“microbial production of human milk oligosaccharidelactodifucotetraose”.metab.eng.66:12-20；苏菲·艾萨尔特等人，cn 116348610a)。dft制备难度大，价格高(140美元/毫克，biosynth carbosynth；11000欧元/克，elicityl)，阻碍了dfl功能研究和应用。因此，构建高效从头合成dfl的重组微生物对dfl的功能研究和生产应用具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是合成二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了重组大肠杆菌。
3、所述重组大肠杆菌为下述任一种：
4、a1)所述重组大肠杆菌含有磷酸甘露糖变位酶基因、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶基因、gdp-l-岩藻糖合成酶基、α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因，不含有β-半乳糖苷酶基因和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因；
5、a2)所述重组大肠杆菌含有磷酸甘露糖变位酶基因、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶基因、gdp-l-岩藻糖合成酶基、α-1,2-岩藻糖基转移酶基因、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因，不含有β-半乳糖苷酶基因和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因；
6、a3)所述重组大肠杆菌含有磷酸甘露糖变位酶基因、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶基因、gdp-甘露糖-4,6-脱水酶基因、gdp-l-岩藻糖合成酶基、α-1,2-岩藻糖基转移酶基因、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因，不含有β-半乳糖苷酶基因、udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因和gdp-d-甘露糖水解酶基因。
7、上述的重组大肠杆菌中，所述重组大肠杆菌还含有融合伙伴基因，所述融合伙伴基因与所述α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因形成融合基因，所述融合伙伴基因为下述任一种基因：
8、b1)热休克蛋白基因；
9、b2)麦芽糖结合蛋白基因；
10、b3)硫氧还蛋白a基因；
11、b4)转录终止抗终止因子基因；
12、b5)蛋白二硫异构酶基因。
13、上文中，所述热休克蛋白基因可为热休克蛋白groes基因和/或groel基因。
14、上文中，所述麦芽糖结合蛋白基因可为麦芽糖结合蛋白mbp基因。
15、上文中，所述硫氧还蛋白a基因可为硫氧还蛋白a trxa基因。
16、上文中，所述转录终止抗终止因子基因可为转录终止抗终止因子nusa基因。
17、上文中，所述蛋白二硫异构酶基因可为蛋白二硫异构酶dsba基因。
18、上文中，所述连接可为通过(g4s)2连接。
19、上文中，所述热休克蛋白groes基因的编码序列(cds)为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为下述任一种：
2.如权利要求所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还含有融合伙伴基因，所述融合伙伴基因与所述α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因形成融合基因，所述融合伙伴基因为下述任一种基因：
3.如权利要求所述1或2的重组大肠杆菌，其特征在于，
4.如权利要求所述1-3中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，
5.如权利要求1-4中所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌按照权利要求6或7所述的方法构建。
6.构建重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括对受体大肠杆菌进行如下任一种操作：
7.权利要求1-4中任一所述的重组大肠杆菌或权利要求5或6所述的方法在制备二岩藻糖基乳糖和/或在制备生产二岩藻糖基乳糖产品和/或在构建产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌中的应用。
8.生物材料在制备二岩藻糖基乳糖和/或在制备生产二岩藻糖基乳糖产品和/或在构建产二岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌中的应用；
9.核酸组合物在制备二岩藻糖基乳糖或在构
10.生产二岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求1-6中任一所述的重组大肠杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到二岩藻糖基乳糖。
...【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为下述任一种：
2.如权利要求所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还含有融合伙伴基因，所述融合伙伴基因与所述α-1,3/4-岩藻糖基转移酶基因形成融合基因，所述融合伙伴基因为下述任一种基因：
3.如权利要求所述1或2的重组大肠杆菌，其特征在于，
4.如权利要求所述1-3中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，
5.如权利要求1-4中所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌按照权利要求6或7所述的方法构建。
6.构建重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括对受体大肠杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，梁山泉，杨绍青，刘丹，闫巧娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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