【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料，尤其涉及一种仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、器官移植是治疗终末期器官功能衰竭的重要手段之一。然而，排斥反应是器官移植患者术后移植物损失的主要原因。虽然fk506(他克莫司)或环孢素a(csa)等免疫抑制药物通常用于缓解移植排斥反应，但长期全身应用这些药物可能导致严重的并发症，如严重感染、恶性肿瘤、高血压、肾毒性等，从而影响移植患者的长期生存和生活质量。因此，迫切需要创新的治疗方法来解决免疫排斥问题，而不需要长期的全身免疫抑制。
2、免疫检查点是重要的免疫调节因子，对于维持免疫系统的自我耐受和防止过度的自身免疫反应至关重要。抑制检查点分子，尤其是被广泛研究的程序性细胞死亡配体1/程序性细胞死亡1(pd-l1/pd-1)负性共刺激通路，在抑制t细胞活化和保持外周耐受性方面发挥着至关重要的作用。最近的研究表明，增强pd-1/pd-l1的相互作用可以减轻心脏、胰岛和角膜移植中的免疫失调，以及同种异体移植物的免疫破坏。例如cheng等人设计了高表达pd-l1的细胞膜源性纳米囊泡(nvs)，增强了pd-l1/pd-1免疫抑制通路，诱导同种异体移植物免疫耐受，从而延长了小鼠皮肤和心脏移植的存活时间。同样，也制备了过表达fgl1/pd-l1的间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡(sev)来减轻免疫排斥。尽管有这些令人鼓舞的进展，但细胞膜来源的nvs和间充质干细胞来源的sev通常都是非特异性的，不能充分靶向地迁移到移植物中，全身给药容易引发非特异性免疫反应并导
3、巨噬细胞是参与移植免疫应答的主要细胞。我们前期的研究发现大量巨噬细胞可以靶向迁移到同种异体移植物中，巨噬细胞的浸润与同种异体移植物的排斥程度密切相关。此外，巨噬细胞还通过抗原加工和递呈抗原对同种异体移植产生适应性同种免疫反应。特别是巨噬细胞中pd-l1的过表达能够抑制cd8+细胞毒性t淋巴细胞的活化。因此，我们认为巨噬细胞高表达pd-l1极可能具有靶向移植物调节t细胞的免疫活性，进而达到有效抑制排斥反应的作用。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，一种仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞及其制备方法和应用。本专利技术提供了一种经仿生聚集诱导发光探针标记的过表达pd-l1基因工程化巨噬细胞(mφpd-l1@ahg)：首先，采用基因转染技术构建稳定表达pd-l1工程巨噬细胞(mφpd-l1)；然后，为了能够追踪工程巨噬细胞在体内的迁移转归，构建了仿生聚集诱导发光探针(ahg)；最后，用ahg标记mφpd-l1构建mφpd-l1@ahg。经静脉给药后，本专利技术中制备的mφpd-l1@ahg能够靶向迁移到同种异体移植皮肤中，抑制t细胞活化与增殖，下调促炎细胞因子，增加调节性t细胞(treg)。
2、为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
3、本专利技术提供了一种仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：
4、①热酸碱法提取葡聚糖粒子(gps)；
5、②将步骤①制备的gps与具有聚集诱导发光效应的荧光分子(hbttpip)共孵育制备具有聚集诱导发光效应的仿生葡聚糖粒子探针(ahg)；
6、③巨噬细胞先孵育过夜，然后与pd-l1慢病毒共培养11～13h，接着加入完全培养基继续孵育47～49h，随后用含有嘌呤霉素的完全培养基换液继续培养，当几乎所有活细胞都表达荧光时，即构建出稳定转染的过表达pd-l1基因工程化巨噬细胞(mφpd-l1)；
7、④先将步骤③构建的mφpd-l1孵育11～13h，然后与步骤②制备的ahg共孵育12～24h，即构建获得仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞(mφpd-l1@ahg)。
8、优选的，所述步骤①的具体过程为：先将安琪酵母分散于naoh中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷却至室温离心获沉淀，接着将沉淀重悬在hcl溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后离心、洗涤、再离心，将得到的沉淀干燥即获得所述gps。
9、优选的，所述步骤②的具体过程为：先将gps混合于去离子水中，随后加入hbttpip乙醇溶液，摇床孵育11～13h，离心收集沉淀，并用去离子水洗涤，即得到所述ahg。
10、进一步优选的，所述gps与所述去离子水的混合方式为：9～11mg gps混合于0.5～1.5ml去离子水中。
11、再优选的，所述hbttpip乙醇溶液中hbttpip的浓度为0.5～1.5mm，hbttpip乙醇溶液的加入量为90～110μl。
12、优选的，所述步骤③中pd-l1慢病毒的moi值为60。
13、优选的，所述步骤③中嘌呤霉素在完全培养基中的浓度为2μg ml-1。
14、优选的，所述步骤④的具体过程为：将mφpd-l10.5～1.5×105接种于6孔板孵育12h后，在培养皿中加入0.5～1.5×107个ahg，再孵育2h，然后将细胞转移入transwell上室，下室中加入含有8～12ngmcp-1的培养基，再孵育12h即可。
15、本专利技术还提供了一种使用所述制备方法制备的仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞。
16、本专利技术还提供了一种所述制备方法或所述仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞在免疫抑制检测和/或治疗产品制备中的应用。
17、与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：
18、(1)本专利技术提供了一种经仿生聚集诱导发光探针标记的过表达pd-l1基因工程化巨噬细胞(mφpd-l1@ahg)：首先，采用基因转染技术构建过表达pd-l1工程巨噬细胞(mφpd-l1)；然后，为了能够追踪工程巨噬细胞在体内的迁移转归，构建了仿生聚集诱导发光探针(ahg)；最后，用ahg标记mφpd-l1构建mφpd-l1@ahg。
19、(2)经静脉给药后，本专利技术中制备的mφpd-l1@ahg能够靶向迁移到同种异体移植皮肤中，抑制t细胞活化与增殖，下调促炎细胞因子，增加调节性t细胞(treg)。
20、(3)本专利技术中制备的mφpd-l1@ahg不仅能够可视化体外回输巨噬细胞在体迁移至移植物，同时其自身以及联合其他免疫抑制剂能够有效抑制移植排斥反应，延长移植物的生存期。本专利技术在器官移植、自身免疫性疾病等的免疫抑制治疗中意义重大。
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1.一种仿生聚集诱导发光探针标记的PD-L1基因工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤①的具体过程为：先将安琪酵母分散于NaOH中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷却至室温离心获沉淀，接着将沉淀重悬在HCL溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后离心、洗涤、再离心，将得到的沉淀干燥即获得所述GPs。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤②的具体过程为：先将GPs混合于去离子水中，随后加入HBTTPIP乙醇溶液，摇床孵育11～13h，离心收集沉淀，并用去离子水洗涤，即得到所述AHG。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述GPs与所述去离子水的混合方式为：9～11mg GPs混合于0.5～1.5mL去离子水中。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述HBTTPIP乙醇溶液中HBTTPIP的浓度为0.5～1.5mM，HBTTPIP乙醇溶液的加入量为90～110μL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤③中嘌呤霉素在完全培养基中的浓度为2μg ml-1。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤④的具体过程为：将MΦPD-L10.5～1.5×105接种于6孔板孵育12h后，在培养皿中加入0.5～1.5×107个AHG，再孵育2h，然后将细胞转移入Transwell上室，下室中加入含有8～12ng MCP-1的培养基，再孵育12h即可。
9.使用权利要求1-8任一所述的制备方法制备的仿生聚集诱导发光探针标记的PD-L1基因工程化巨噬细胞。
10.权利要求1-8任一所述的制备方法或权利要求9所述的仿生聚集诱导发光探针标记的PD-L1基因工程化巨噬细胞在免疫抑制检测和/或治疗产品制备中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种仿生聚集诱导发光探针标记的pd-l1基因工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤①的具体过程为：先将安琪酵母分散于naoh中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷却至室温离心获沉淀，接着将沉淀重悬在hcl溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后离心、洗涤、再离心，将得到的沉淀干燥即获得所述gps。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤②的具体过程为：先将gps混合于去离子水中，随后加入hbttpip乙醇溶液，摇床孵育11～13h，离心收集沉淀，并用去离子水洗涤，即得到所述ahg。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述gps与所述去离子水的混合方式为：9～11mg gps混合于0.5～1.5ml去离子水中。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述hbttpip乙醇溶液中hbttpip的浓度为0.5～1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽，王文渊，高瑭，谢明星，季翔，王一卉，王睿，王禄芳，何梦荣，朱业，张紫桑，靳巧锋，李玉曼，周武祺，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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