【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水产生物，更具体地，涉及一种快速培养三代虫的方法。
技术介绍
1、三代虫(gyrodactylids)隶属于扁形动物门(platyhelminthes)单殖吸虫纲(monogenea)三代虫目(gyrodactylidea)，三代虫科(gyrodactylidae)，三代虫属(gyrodactylus)，主要寄生在鱼的体表和鳃，广泛分布于世界各地海水和淡水水域，能感染绝大多数鱼类。三代虫虫体略呈纺锤形，长度一般为0.3～0.8mm，是专性寄生虫且具有宿主特异性，现已报道400余种，近年来仍有新种不断被发现。
2、三代虫生殖方式为胎生，并且具有独特的超胎生生殖现象和幼体生殖能力，能够在短时间内快速增殖，而且三代虫很容易依靠宿主间接触横向传播，在给养殖鱼类带来严重危害的同时，也可以作为研究寄生虫与宿主鱼相互作用机制的良好模型。
3、三代虫生存的适宜温度一般为20℃左右，三代虫病多流行于春末夏初，对鱼苗及春花鱼种危害很大，能造成鱼体体表创伤，引发细菌等病原的二次感染。鱼类寄生该虫后，可见鱼体粘液异常分泌，充血及斑点状出血斑，病鱼皮肤上形成灰蓝色无光泽的粘液膜，极度不安，狂游于水中，或是身体摩擦池壁游动，食欲不振、消瘦以致死亡。镜检时常可见病鱼体表、各鳍以及鳃部有该虫的寄生。
4、鲑鱼三代虫gyrodactylus salaris曾使挪威的野生大西洋鲑(salmo salar)种群遭受毁灭性打击，并且近年间有扩大传播范围的趋势，严重影响鲑鱼养殖鱼类的发展，给养殖户带来了巨大的经济损失；根
5、然而，由于三代虫目前还无法实现体外培养，实验室内培养具有很大难度，研究人员难以随时获得足够样品，所以三代虫的相关研究特别是三代虫与宿主鱼之间的免疫相互作用的研究非常少，大大阻碍了相关药物与疫苗的研发。
6、目前国内仅报道过一种三代虫实验模型：“小林三代虫-金鱼”感染实验模型(涂笑,2019.牛蒡子苷元作用鱼类单殖吸虫靶标及机制研究.西北农林科技大学)，其主要步骤为：通过吡喹酮浸泡获得无虫感染金鱼、尾鳍人工接种小林三代虫、三代虫种类鉴定和种群维持等。该模型的主要缺点在于：
7、(1)三代虫感染丰度具有先上升后下降的规律性，通常7天左右达到感染高峰期，14天左右感染丰度消退至最低点甚至是0，所以通过一批金鱼得到大量的小林三代虫至少需要7天左右的时间，并且要维持三代虫的种群规模必须要在14天内加入一些新的未感染的金鱼，这样也大大增加了时间成本与经济成本，无法按照需求随时获得大量三代虫材料；
8、(2)有至少7种三代虫可以寄生于金鱼，所以小林三代虫的单种维持难度较大，在需要保证培养得到的三代虫为单一种群的情况中，每次补充维持种群用的金鱼时都要先经过杀虫并恢复的过程，如果不小心保种中断，重新保种又要经历繁琐的三代虫单种鉴定与单种培养过程，增加了操作难度与时间成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速培养三代虫的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
3、一种快速培养三代虫的方法，包括以下步骤：
4、s1.选择三代虫初期感染量为5～10条的幼鱼，得到挑选后幼鱼；
5、s2.给步骤s1所述挑选后幼鱼注射免疫抑制剂，得到注射后幼鱼；
6、s3.培养注射后幼鱼，至注射后幼鱼三代虫等于或超过步骤s1所述三代虫感染量的目标倍数，培养过程结束；所述培养在不含所述幼鱼的致病微生物的养殖用水中进行，水温为24～26℃。
7、优选地，所述三代虫为丽鱼三代虫。
8、优选地，步骤s1中所述幼鱼为罗非鱼幼鱼。
9、更优选地，步骤s1中所述幼鱼为齐氏罗非鱼幼鱼、伽利略罗非鱼幼鱼、尼罗罗非鱼幼鱼或莫桑比克罗非鱼幼鱼。
10、最优选地，步骤s1中所述幼鱼为尼罗罗非鱼幼鱼。
11、根据专利技术人前期的调查研究发现，尼罗罗非鱼幼鱼幼鱼身上只确定有一种三代虫寄生，即丽鱼三代虫，在需要保证培养得到的三代虫为单一种群的背景下，使用尼罗罗非鱼幼鱼幼鱼作为三代虫培养过程中的宿主鱼可以避免“金鱼-小林三代虫”模型中要经常对三代虫进行鉴定以及单种保种的复杂操作，大大提高了实验效率。而且，所需要的宿主鱼常见且成本低廉。
12、优选地，步骤s1中所述幼鱼的规格为：体长3～5cm，体重1～3g。
13、优选地，所述三代虫初期感染量为5～10条的幼鱼的制备方法为：健康幼鱼置于消毒后的饲养池中，向所述饲养池中投放携带三代虫的鱼鳍，12～36h后取出所述鱼鳍，每隔12～36h镜检所述健康幼鱼的三代虫感染情况，选择三代虫感染量为5～10条的幼鱼。
14、优选地，步骤s2中，所述免疫抑制剂为地塞米松、地塞米松药学上可接受的盐、他克莫司、他克莫司药学上可接受的盐、雷帕霉素或雷帕霉素药学上可接受的盐。
15、更优选地，步骤s2中，所述免疫抑制剂为地塞米松或地塞米松药学上可接受的盐。
16、最优选地，步骤s2中，注射量为鱼每克体重0.1mg地塞米松磷酸钠。
17、进一步最优选地，步骤s2中，所述免疫抑制剂为浓度为1～5mg/ml的地塞米松磷酸钠。
18、作为具体实施的参考，按照鱼每克体重20μl的注射量，给步骤s1挑选得到的幼鱼注射浓度为5mg/ml的兽用地塞米松磷酸钠注射液。
19、优选地，步骤s2中，注射的位置为腹鳍基部。
20、作为具体实施的参考，步骤s2中，将步骤s1挑选得到的幼鱼麻醉后在腹鳍基部倾斜约45度进针扎入腹腔进行腹腔注射免疫抑制剂，注射后停留5秒以上再将针头拔出。
21、优选地，步骤s3中，每隔12～36h观察一次幼鱼体表，至注射后幼鱼三代虫等于或超过步骤s1所述三代虫感染量的目标倍数，培养过程结束。
22、更优选地，步骤s3中，所述目标倍数不高于所述幼鱼的三代虫最高感染量。
23、最优选地，步骤s3中，所述目标倍数为10倍。
24、优选地，步骤s3中，所述不含所述幼鱼的致病微生物的养殖用水为已灭菌曝气后的养殖用水。
25、更优选地，步骤s3中，所述培养为将注射后幼鱼单独养在已灭菌曝气后的养殖用水里。
26、所述方法在构建“三代虫-罗非鱼”感染模型中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
27、与现有技本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速培养三代虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述三代虫为丽鱼三代虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述幼鱼为罗非鱼幼鱼。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述幼鱼的规格为：体长3～5cm，体重1～3g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述三代虫初期感染量为5～10条的幼鱼的制备方法为：健康幼鱼置于消毒后的饲养池中，向所述饲养池中投放携带三代虫的鱼鳍，12～36h后取出所述鱼鳍，每隔12～36h镜检所述三代虫感染情况，选择三代虫感染量为5～10条的幼鱼。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述免疫抑制剂为地塞米松、地塞米松药学上可接受的盐、他克莫司、他克莫司药学上可接受的盐、雷帕霉素或雷帕霉素药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述免疫抑制剂为地塞米松或地塞米松药学上可接受的盐。
8.根据权利要求7所述的方法，
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，注射的位置为腹鳍基部。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，注射后每隔12～36h观察一次幼鱼体表，幼鱼三代虫感染量等于或超过步骤S1所述三代虫感染量的目标倍数时，培养过程结束。
...【技术特征摘要】
1.一种快速培养三代虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述三代虫为丽鱼三代虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述幼鱼为罗非鱼幼鱼。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述幼鱼的规格为：体长3～5cm，体重1～3g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述三代虫初期感染量为5～10条的幼鱼的制备方法为：健康幼鱼置于消毒后的饲养池中，向所述饲养池中投放携带三代虫的鱼鳍，12～36h后取出所述鱼鳍，每隔12～36h镜检所述三代虫感染情况，选择三代虫感染量为5～10条的幼鱼。
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲松，支婷婷，骆磊，杨廷宝，黄盛丰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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