一种ssDNA核酸适配体及其的溶藻弧菌快速检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体及其筛选方法、检测方法与应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA‑3’(SEQ ID NO：1)或5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG‑CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA‑CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’(SEQ ID NO：2)。本发明专利技术的ssDNA核酸适配体对溶藻弧菌具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体具有结构稳定、易修饰，便于合成和保存的优点，可应用于对溶藻弧菌进行快速准确的检测过程和诊断过程。

A ssDNA aptamer and its application in rapid detection of Vibrio alginolyticus

The present invention discloses a ssDNA nucleic acid aptamer for specific identification of Vibrio alginolyticus and its screening method, detection method and application. The nucleotide sequence of the ssDNA nucleic acid aptamer is 5 'SEQ ID NO:1, or 5' GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG CTTCTATCTACAT. TTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC 3 \(SEQ ID NO:2). The ssDNA aptamer is specific and highly sensitive to Vibrio alginolyticus, and has no immunogenicity. The ssDNA aptamers have the advantages of stable structure, easy modification, easy to synthesize and preserve, and can be used for rapid and accurate detection and diagnosis of Vibrio alginolyticus.

【技术实现步骤摘要】
一种ssDNA核酸适配体及其的溶藻弧菌快速检测中的应用
本专利技术涉及一种ssDNA核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种ssDNA核酸适配体及其的溶藻弧菌快速检测中的应用。
技术介绍
我国作为水产养殖大国，占世界水产品养殖总量的70％。然而，近年由于细菌性病原的暴发及流行导致了我国的水产养殖行业的巨大经济损失。特别是在广西等华南沿海地区，溶藻弧菌导致海水养殖鱼类发生细菌性鱼病，其引起的鱼病发病迅速、死亡率高、流行面广，对着华南地区水产养殖业发展具有严重威胁。目前国际上对鱼类细菌性疾病的诊断主要采用传统观察法、免疫学检测方法、分子生物学技术等。但这些方法存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵、精确度不高等问题，不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断。指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichmenttechnology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达1014-1015的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测水产致病菌溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断的问题。本专利技术的目地在于提供一种可特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA-3’(SEQIDNO：1)。进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA-CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’(SEQIDNO：2)。更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、双(2,2`-联吡啶)(4,4`-二羧基-2,2`-联吡啶)钌配体中的一种或多种。本专利技术的另一目地在于提供一种上述ssDNA核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：随机文库Library50：5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’；FITC标记的5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；Biotin标记的5’引物：5’-Biotin-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；TAMRA标记的5’引物：5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于300-500μlPBS中，在80-95℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴5-20min，取处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，并在92℃下恒温水浴5-30min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库；步骤3：取100-200ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库进行PCR扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过15-25轮循环，72℃5min；步骤4：取100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中扩增所得的双链DNA在常温下孵育15-30min，使用磁性分离器吸取磁珠并除去上清，用1-4mLPBS洗涤磁珠后，加入100-200μl的200mMNaOH溶液，常温反应5-20min，并利用磁性分离架回收磁珠，留取上清液；步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入300-500μlPBS，得到含有DNA单链文库的溶液；步骤6：取步骤5中得到的DNA单链文库代替步骤2中的随机文库，并重复步骤2-55-8次；步骤7：取步骤6的DNA文库于80-95℃恒温水浴中加热5-20min，然后迅速进行冰浴，冰浴5-20min，取处理后的DNA单链文库的溶液与嗜水气单胞菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心并收集上清液，将上清溶液与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心移除上清，取10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，并在80-95℃下恒温水浴5-30min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库；步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssDNA核酸适配体。进一步地，所述引物还包括Biotin标记的3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’(SEQIDNO：3)。本专利技术的另一目地在于提供上述ssDNA核酸适配体在溶藻弧菌快速检测中的应用方法，包括以下步骤：步骤1：对ssDNA核酸适配体进行生物素标记；步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nM的ssDNA核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20-40min；待孵育结合后，清洗待测样品，并加入100-200μl由辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，在冰上再次进行孵育结合10-40min，孵育结合后用PBS溶液清洗待测样品，并加入辣根过氧化物酶显色试剂盒中进行TMB显色液显色，使用酶标仪读取待测样品在450nm处的吸光值并记录结果，根据吸光值的变化检测待测样品中是否含有溶藻弧菌。本专利技术还有一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体在检测溶藻弧菌中的用途。本专利技术相对于现有技术，通过SELEX技术筛选得到的ssDNA核酸适配体，并通阴性筛选除去ssDNA核酸适配体中的非特异性成份，有效提高ssDNA核酸适配体的特异性，相比于现有的蛋白抗体具有更高的亲和力和特异性，同时具有无免疫原性、制备周期短、重现性好、分子量小等优点，可以进行体外的化学合成进行大量生产。此外基于本专利技术ssDNA核酸适配体对溶藻弧菌进行ELISA检测时，操作简单、快速。附图说明图1为本专利技术实施例1、实施例2、对照例中ssDNA核酸适配体的ELISA检测吸光值对比图；图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA‑3’(SEQ ID NO：1)。

【技术特征摘要】
1.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA-3’(SEQIDNO：1)。2.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-CTTCTATCTACATTTCTTTTTCGTCAATTTTTATTCCCTGGCCCACCCTA-CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’(SEQIDNO：2)。3.根据权利要求1或2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。4.根据权利要求1或2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。5.根据权利要求4所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、双(2,2`-联吡啶)(4,4`-二羧基-2,2`-联吡啶)钌配体中的一种或多种。7.一种如权利要求1或2所述ssDNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：随机文库Library50：5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’；FITC标记的5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；Biotin标记的5’引物：5’-Biotin-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；TAMRA标记的5’引物：5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于300-500μlPBS中，在80-95℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴5-20min，取处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，并在92℃下恒温水浴5-30min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库；步骤3：取100-200ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库进行PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏飞，秦启伟，余庆，陈波，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45