【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于毒性评价，具体涉及一种基于果蝇行为评价吴茱萸提取物微量毒性的模型及其构建方法与应用。
技术介绍
1、中药微量毒性物质的评价，不同于化学药物和生物药评价，中药毒性具有现代生物技术难以检测的微小毒性特点，是中药安全性评价一直面临的关键问题之一。如何准确、快速、高效地评价中药的微小毒性，是中药毒性研究正面临的关键问题。
2、果蝇模式生物具有灵敏的嗅觉和味觉感受系统，能对微弱的中药有毒气味产生行为上的反应，利用果蝇模式生物对中药气味的体内外结合研究，目前还未见报道。
技术实现思路
1、为了准确、快速、高效地评价吴茱萸提取物的微小毒性，避免果蝇的每个行为学实验的对应指数可能存在的波动性，更好地反应果蝇嗅觉及味觉行为，本专利技术基于果蝇的行为构建了一种评价吴茱萸提取物微量毒性的模型，该模型具有准确性高、快速、高效的特点，可应用于吴茱萸提取物毒性的评估。
2、为解决上述技术问题，并实现相应的技术效果，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种基于果蝇行为的评价吴茱萸微量毒性模型的构建方法，该方法包括如下步骤：
4、s1、以1％蔗糖溶剂配置不同浓度的吴茱萸提取物溶液，利用急性毒性实验检测不同浓度下果蝇的死亡率，并获得lc80、lc65、lc50、lc35、lc20对应浓度；
5、s2、湿饥饿处理后的果蝇进行由双向选择摄食实验、y型实验及展吻实验按顺序组成的串联实验，分别获得偏好指数pi，嗅觉指数oi
6、s3、运用spss statistics 27进行线性回归，求出嗅觉及味觉行为综合评判指数popi线性回归方程；
7、s4、根据s3所述的线性回归方程计算lc50对应浓度及待测浓度吴茱萸提取物溶液的综合评判指数popi，将两个popi进行比较即评估出待测浓度吴茱萸提取物溶液的毒性是否达到致死中浓度。
8、在本专利技术的一种实施方式中，s1检测不同浓度下果蝇的死亡率的方法是将干净的棉花球塞入离心管中，随后将配好的不同浓度的吴茱萸提取物溶液分别加入不同的离心管中，每管分别加入800μl吴茱萸提取物溶液，然后每管放20只经24h湿饥饿处理的雌性果蝇，24h后统计死亡率。
9、在本专利技术的一种实施方式中，s2中双向选择摄食实验所用培养基的配置方法是取二分格细胞培养皿，分别设置ab侧，a侧由吴茱萸提取物溶液、琼脂糖、brilliant blue fcf组成；b侧由与a侧吴茱萸提取物溶液等量的1％蔗糖溶液、与a侧等量的琼脂糖及sulforhodamine b组成。
10、在本专利技术的一种实施方式中，s2中双向选择摄食实验方法是将提前进行24h湿饥饿处理好的3-4d的成年雌性果蝇放入不同浓度吴茱萸提取物溶液的双向选择培养基中，每组40只，在黑暗室温条件下，进行90min的双向选择摄食，摄食完成后，用二氧化碳麻醉，在体视显微镜下观察每组果蝇的腹部颜色，并进行统计，求出偏好指数pi，pi＝(红色数量-蓝色数量)/(红色数量+蓝色数量+紫色数量)。
11、在本专利技术的一种实施方式中，s2中y型实验所使用的装置是用玻璃u型连接管和橡胶塞连接三个平底的试管，形成的y型实验装置，y型实验装置仅有一个试管的一端为初始管，另一端的两个试管分别为刺激管和对照管。
12、在本专利技术的一种实施方式中，s2中y型实验方法是在刺激管中放入棉花球并加入吴茱萸提取物溶液，对照管中放入棉花球并加入等体积的1％蔗糖溶液，将进行过不同浓度双向选择摄食实验的果蝇分别放入对应浓度的初始管中，随后组装y型实验装置，记时开始实验，每30分钟统计刺激管和对照管中的果蝇数，共统计4-5次，合并每个浓度每个时间段的果蝇数，计算出每个浓度刺激管和对照管管中的果蝇平均数，最后，计算嗅觉指数oi，oi＝刺激管中的果蝇数量/(刺激管中的果蝇数量+对照管中的果蝇数量)。
13、在本专利技术的一种实施方式中，s2中展吻实验是将进行过y型实验的果蝇用co2麻醉，然后将果蝇限制在切割好的200ml移液器吸头内，以便暴露其头部和长鼻，同时限制其身体和跗节，在加湿箱中经过60min的适应期后，向果蝇提供水并允许其自由饮水直至满足，5min内未停止对水做出反应的果蝇被丢弃；使用尖头的棉签在对应浓度的吴茱萸提取物溶液中浸泡，然后将带有吴茱萸提取物溶液的棉签手动施加到果蝇长鼻尖端1-2秒，并监测长鼻伸展反射；使用三个值对展吻测定进行评分，1.0分表示果蝇在嗅到浸泡后的棉签伸出长鼻并摄食1.0秒，如果蝇伸出喙并消耗食物的时间小于1.0秒，则得分为0.5，如果果蝇未能伸出其喙，则得分为0，对每只果蝇进行了3次连续展吻测定，间隔1分钟，每次实验的展吻指数peri计算公式为：peri＝得分数总和/测试的果蝇数量。
14、在本专利技术的一种实施方式中，s4评估出待测浓度吴茱萸提取物溶液的毒性是否达到致死中浓度的方法为若待测浓度吴茱萸提取物溶液的popi大于lc50对应浓度的popi，则待测浓度吴茱萸提取物溶液低于致死中浓度；若待测浓度吴茱萸提取物溶液的popi小于lc50对应浓度的popi，则待测浓度吴茱萸提取物溶液高于致死中浓度。
15、本专利技术的第二个目的是提供上述构建方法获得的基于果蝇行为的评价吴茱萸提取物微量毒性的模型。
16、本专利技术的第三个目的是提供上述评价吴茱萸提取物微量毒性模型在评价吴茱萸提取物微量毒性中的应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于果蝇行为评价吴茱萸提取物微量毒性模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1检测不同浓度下果蝇的死亡率的方法是利用急性毒性实验，将经24h湿饥饿处理的雌性果蝇分别放入含有不同浓度吴茱萸提取物溶液的容器中，24h后统计死亡率。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S2中双向选择摄食实验所用培养基的配置方法是取二分格细胞培养皿，分别设置AB侧，A侧由中吴茱萸提取物溶液、琼脂糖、Brilliant Blue FCF组成；B侧为对照，由与A侧吴茱萸提取物溶液等量的1％蔗糖溶液、与A侧等量的琼脂糖及Sulforhodamine B组成。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S2中双向选择摄食实验方法是将提前进行24h湿饥饿处理好的3-4d的成年雌性果蝇放入对应浓度吴茱萸提取物溶液双向选择培养基中，每组40只，在黑暗室温条件下，进行90min的双向选择摄食，摄食完成后，用二氧化碳麻醉，在体视显微镜下观察每组果蝇的腹部颜色，并进行统计，求出偏好指数PI，PI＝(红色数量-蓝色数
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S2中Y型实验所使用的装置是用玻璃U型连接管和橡胶塞连接三个平底的试管，形成的Y型实验装置，Y型实验装置仅有一个试管的一端为初始管，另一端的两个试管分别为刺激管和对照管。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，S2中Y型实验方法是在刺激管中放入棉花球并加入吴茱萸提取物溶液，对照管中放入棉花球并加入等体积的1％蔗糖溶液，将进行过不同浓度双向选择摄食实验的果蝇分别放入对应浓度的初始管中，随后组装Y型实验装置，记时开始实验，每30分钟统计刺激管和对照管中的果蝇数，共统计4-5次，合并每个浓度每个时间段的果蝇数，计算出每个浓度刺激管和对照管管中的果蝇平均数，最后，计算嗅觉指数OI，OI＝刺激管中的果蝇数量/(刺激管中的果蝇数量+对照管中的果蝇数量)。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，S2中展吻实验是将进行过Y型实验的果蝇用CO2麻醉，然后暴露果蝇头部和长鼻，同时限制果蝇身体和跗节，在加湿箱中经过60min的适应期后，向果蝇提供水并允许其自由饮水直至满足，5min内未停止对水做出反应的果蝇被丢弃；使用棉签在对应浓度的吴茱萸提取物溶液中浸泡，然后将带有吴茱萸提取物溶液的棉签施加到果蝇长鼻尖端1-2秒，并监测长鼻伸展反射；使用三个值对展吻测定进行评分，1.0分表示果蝇在嗅到浸泡后的棉签伸出长鼻并摄食1.0秒，如果蝇伸出喙并消耗食物的时间小于1.0秒，则得分为0.5，如果果蝇未能伸出其喙，则得分为0，对每只果蝇进行了3次连续展吻测定，间隔1分钟，每次实验的展吻指数计算公式为：PERI＝得分数总和/测试的果蝇数量。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S4评估出待测浓度吴茱萸提取物溶液的毒性是否达到致死中浓度的方法为若待测浓度吴茱萸提取物溶液的POPI大于LC50对应浓度的POPI，则待测浓度吴茱萸提取物溶液低于致死中浓度；若待测浓度吴茱萸提取物溶液的POPI小于LC50对应浓度的POPI，则待测浓度吴茱萸提取物溶液高于致死中浓度。
9.权利要求1-8所述构建方法获得的评价吴茱萸提取物微量毒性的模型。
10.权利要求9所述评价吴茱萸微量毒性模型在评价吴茱萸提取物微量毒性中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于果蝇行为评价吴茱萸提取物微量毒性模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1检测不同浓度下果蝇的死亡率的方法是利用急性毒性实验，将经24h湿饥饿处理的雌性果蝇分别放入含有不同浓度吴茱萸提取物溶液的容器中，24h后统计死亡率。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s2中双向选择摄食实验所用培养基的配置方法是取二分格细胞培养皿，分别设置ab侧，a侧由中吴茱萸提取物溶液、琼脂糖、brilliant blue fcf组成；b侧为对照，由与a侧吴茱萸提取物溶液等量的1％蔗糖溶液、与a侧等量的琼脂糖及sulforhodamine b组成。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，s2中双向选择摄食实验方法是将提前进行24h湿饥饿处理好的3-4d的成年雌性果蝇放入对应浓度吴茱萸提取物溶液双向选择培养基中，每组40只，在黑暗室温条件下，进行90min的双向选择摄食，摄食完成后，用二氧化碳麻醉，在体视显微镜下观察每组果蝇的腹部颜色，并进行统计，求出偏好指数pi，pi＝(红色数量-蓝色数量)/(红色数量+蓝色数量+紫色数量)。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s2中y型实验所使用的装置是用玻璃u型连接管和橡胶塞连接三个平底的试管，形成的y型实验装置，y型实验装置仅有一个试管的一端为初始管，另一端的两个试管分别为刺激管和对照管。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，s2中y型实验方法是在刺激管中放入棉花球并加入吴茱萸提取物溶液，对照管中放入棉花球并加入等体积的1％蔗糖溶液，将进行过不同浓度双向选择摄食实验的果蝇分别放入对应浓度的...
【专利技术属性】
技术研发人员：高月，王宇光，张程，师卓，杨春启，马增春，汤响林，王一豪，孙德志，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。