甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用制造技术

本发明专利技术提供了甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过对甲基对硫磷酸水解酶中L83，G119，G82，V118位点进行定点突变，获得系列催化效率提高的甲基对硫磷酸水解酶突变体，提高了对有机磷农药的降解能力，具有好的工业应用前景和社会及经济价值。

【技术实现步骤摘要】
甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用
本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用。
技术介绍
有机磷化合物如对硫磷和甲基对硫磷是人类中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的强烈抑制剂，其摄入会导致神经系统功能的逐步丧失，甚至导致死亡，是一类高毒的化合物。但这类化合物在世界范围内仍然被广泛用来控制农业虫害。食品和环境中的有机磷农药残留给人类的生命健康造成了巨大的威胁。有机磷农药降解酶可以高效的水解有机磷农药，生成低毒的小分子化合物，本身无毒无害，为解决食品和环境中农药残留问题提供了一条安全绿色的途径。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体具有较好的有机磷化合物水解能力，能够应用于环境污染治理中。本专利技术的第二目的在于提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，该编码基因能编码上述的用于降解有机磷化合物的甲基对硫磷酸水解酶突变体。本专利技术的第三目的在于提供含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。本专利技术的第四目的在于提供含有上述甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。本专利技术的第五目的在于提供上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。本专利技术的第六目的在于提供上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：甲基对硫磷酸水解酶突变体，与SEQIDNO.1所示的序列相比，甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第83位突变L83C、第119位突变G119C、第82位突变G82Q和第118位突变V118A中的至少一种。一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因编码上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过提供甲基对硫磷酸水解酶突变体具有较高的酶活力，通过甲基对硫磷酸水解酶突变体较好的酶活，提高了对有机磷化合物的降解能力，不同的突变类型的酶活力具有不同程度的提高，具有好的工业应用前景和社会及经济价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实验例提供的野生型MPH的产酶能力时间诱导曲线图；图2为本专利技术实验例提供的突变型MPH产酶能力时间诱导曲线图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。KOD-Plus-Neo高保真PCR酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。内切酶，连接酶及T4PolynucleotideKinase购自ThermoFisherScientific公司。Zeocin与Bradford试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒与质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。底物甲基对硫磷标品购自北京坛墨质检科技有限公司。LLB(低盐LB)培养基用于培养大肠杆菌(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，0.5％NaCl)、YPD培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)用于培养毕赤酵母。YPG培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)用于BMMY培养基诱导前毕赤酵母增菌。BMMY培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％biotin，0.5％甲醇)用于毕赤酵母摇瓶诱导产酶。BSM培养基(85％磷酸26.7mL/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM14.35mL/L)用于发酵罐毕赤酵母产酶。下面对本专利技术实施例的甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用进行具体说明。甲基对硫磷水解酶(MPH)为目前文献报道比活力较高的有机磷水解酶，其对甲基对硫磷的水解活力可达到50.5U/mg。进一步提高MPH的催化效率，对于降低其生产成本，促进其大规模的工业化应用具有重要意义。目前已经有一系列通过定向进化或理性设计的方法对MPH进行改造以提高其催化效率的案例。甲基对硫磷酸水解酶突变体，与SEQIDNO.1所示的序列相比，甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第83位突变L83C、第119位突变G119C、第82位突变G82Q和第118位突变V118A中的至少一种。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，优选地，包括对应SEQIDNO.1所示的序列的第82位突变G82Q或第118位突变V118A。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，优选地，包括对应SEQIDNO.1所示的序列的第83位突变L83C和第119位突变G119C。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，优选地，包括对应SEQIDNO.1所示的序列的第83位突变L83C、第119位突变G119C、第82位突变G82Q和第118位突变V118A。一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因编码上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。将含有甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因通过基因工程的算克隆到表达载体，可以通过表达载体大量表达获得较多的具有较高有机磷化合物降解能力的甲基对硫磷酸水解酶突变体。避免自然菌种表达的效率低下的问题。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，重组菌的宿主菌为酵母菌。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体与SEQIDNO.1所示的序列相比，具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第82位突变G82Q或第118位突变V118A。本实施例还提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，编码基因编码具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第82位突变G82Q的甲基对硫磷酸水解酶突变体。或者编码基因编码具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第118位突变V118A的甲基对硫磷酸水解酶突变体。本专利技术实施例还提供一种编码具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第82位突变G82Q或第1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甲基对硫磷酸水解酶突变体，其特征在于，与SEQ ID NO.1所示的序列相比，所述甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应SEQ ID NO.1所示的序列的第83位突变L83C、第119位突变G119C、第82位突变G82Q和第118位突变V118A中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.甲基对硫磷酸水解酶突变体，其特征在于，与SEQIDNO.1所示的序列相比，所述甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应SEQIDNO.1所示的序列的第83位突变L83C、第119位突变G119C、第82位突变G82Q和第118位突变V118A中的至少一种。2.根据权利要求1所述的甲基对硫磷酸水解酶突变体，其特征在于，优选地，包括对应SEQIDNO.1所示的序列的所述第82位突变G82Q或所述第118位突变V118A。3.根据权利要求1所述的甲基对硫磷酸水解酶突变体，其特征在于，优选地，包括对应SEQIDNO.1所示的序列的所述第83位突变L83C和所述第119位突变G119C。4.根据权利要求1所述的甲基对硫磷酸水解酶突变体，其特征在于，优选地，包括对应SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾世超，詹志春，周樱，谌颉，张成杰，吴启涛，
申请(专利权)人：武汉新华扬生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42