一种猪瘟病毒（CSFV）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、CSFV检测引物T7引物和nT7引物、CSFV检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明专利技术试剂盒能够检测猪脏器，排泄物，组织培养物中的RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规50分钟完成检测)的特点，将在畜牧养殖业健康养殖及安全肉制品监管发挥重要作用，应用前景广阔。

A real-time fluorescent nucleic acid thermostable amplification kit for detection of classical swine fever virus (CSFV)

The invention discloses a real-time fluorescence nucleic acid isothermal amplification detection kit for classical swine fever virus (CSFV). These include: capture probe, CSFV primer T7 primer and nT7 primer, CSFV probe, M MLV reverse transcriptase, T7 RNA polymerase and other reagents. The kit can detect RNA in pig organs, excrement and tissue culture, which has the characteristics of high specificity, high sensitivity (up to 100copies/ reaction), low pollution (RNA in natural environment under natural environment) and rapid detection (routine 50 minutes test), which will be used in the healthy breeding and safe meat of livestock breeding industry. Product supervision plays an important role and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒(CSFV)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
本专利技术涉及病毒的生物检测
，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及实时荧光核酸恒温扩增检测技术对猪瘟病毒(CSFV)进行检测的试剂盒。通过本专利技术的试剂盒可实现对组织样本，排泄物，组织培养物等样品中CSFV核酸的检测。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病，猪是该病毒唯一的自然宿主，病猪排泄物和分泌物是主要传染源，不同年龄、性别、品种的家猪和野猪都易感，一年四季均可发生。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，并可能带有神经症状；母猪感染后可能会流产或产下死猪崽。猪瘟被世界动物卫生组织定为A类传染病，在家猪和业主之间广泛传播，发达国家采取捕杀来消灭CSF，但在世界上许多国家和地区，猪瘟仍频繁爆发，给畜牧和养殖业造成重大损失。猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，它与同属的牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)，羊边界病毒(Borderdiseasevirus，BDV)存在一定的抗原交叉性，而后两者病毒也可以感染猪，同时它们感染后的症状相似，血清学上不易区分CSFV与后两者病毒，但是以核酸体外诊断为代表的基因检测方法可以很好的区分。目前CSFV的主要检测方法有：病毒分离培养法、血清学检查和RT-PCR法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。RT-PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
技术实现思路
为解决现有的猪瘟病毒(CSFV)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本专利技术提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的猪瘟病毒(CSFV)实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。本专利技术所提供的猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的猪瘟病毒(CSFV)的靶标核酸(CSFVRNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生CSFV靶标核酸(CSFVRNA)的DNA拷贝的CSFV扩增引物T7和nT7，一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述CSFV靶标核酸(CSFVRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的CSFV检测探针，可与CSFV靶标核苷酸(CSFVRNA)使用同一对引物(T7和nT7)的CSFV的竞争性内标和内标检测探针。所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的猪瘟病毒(CSFV)的靶标核酸(CSFVRNA)序列特异结合，在有CSFV内标(CSFVICRNA)时，其最好还可与该CSFV内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述CSFV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述CSFV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；所述的CSFV内标由序列表中序列7所示的含CSFV内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和CSFV检测探针、内标检测探针存在于一CSFV检测液中。更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、CSFV反应液、CSFV检测液、SAT酶液、CSFV阳性对照、CSFV阴性对照和CSFV内标，其中：裂解液：含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES；核酸提取液：含捕获探针和磁珠；洗涤液：含NaCl和SDS。CSFV反应液：含dNTP和NTP；CSFV检测液：含T7引物、nT7引物、CSFV检测探针和内标检测探针；SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；CSFV阳性对照；含猪瘟病毒(CSFV)5’-UTR的体外转录RNA稀释物；CSFV阴性对照：不含有猪瘟病毒(CSFV)靶标核酸(CSFVRNA)序列或不含有猪瘟病毒的溶液，如生理盐水；CSFV内标：含CSFV内标RNA(CSFVICRNA，序列如序列表中序列7所示)稀释物。具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；(2)核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1％SDS，EDTA1-10mM；(4)CSFV反应液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10％，KCl5-40mM；(5)CSFV检测液：将CSFV扩增引物和CSFV检测探针溶解在TE溶液(10mMTris和1mMEDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，CSFV检测探针浓度优选为5pmol/反应；(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mMEDTA、0.1-1％(v/v)TritonX-100和20-50％(v/v)glycerol；(7)CSFV阳性对照；含105-108拷贝/mL猪瘟病毒(CSFV)5’-UTR的体外转录RNA稀释物；(8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪瘟猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的猪瘟病毒的靶标核酸CSFV RNA序列特异结合的捕获探针，一对用于在M‑MLV反转录酶作用下产生CSFV靶标核酸的DNA拷贝的CSFV扩增引物T7和nT7，一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述CSFV靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的CSFV检测探针，以及可与CSFV靶标核苷酸CSFV RNA使用同一对引物即T7和nT7的竞争性内标和内标检测探针；其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述CSFV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述CSFV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；所述CSFV内标由序列表中序列7所示的含CSFV内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的猪瘟病毒的靶标核酸CSFVRNA序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生CSFV靶标核酸的DNA拷贝的CSFV扩增引物T7和nT7，一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述CSFV靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的CSFV检测探针，以及可与CSFV靶标核苷酸CSFVRNA使用同一对引物即T7和nT7的竞争性内标和内标检测探针；其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述CSFV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述CSFV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；所述CSFV内标由序列表中序列7所示的含CSFV内标RNA，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含SAT酶液，所述SAT酶液为包含M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶的混合物，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和CSFV检测探针、内标检测探针存在于一CSFV检测液中。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、CSFV反应液、CSFV检测液、SAT酶液、CSFV阳性对照、CSFV阴性对照和CSFV内标，其中：裂解液：含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES；核酸提取液：含捕获探针和磁珠；洗涤液：含NaCl和SDS；CSFV反应液：含dNTP和NTP；CCSFV检测液：含T7引物、nT7引物、CSFV检测探针和内标检测探针；SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；CSFV阳性对照；含猪瘟病毒5’-UTR的体外转录RNA稀释物；CSFV阴性对照：不含有猪瘟病毒靶标核酸序列或不含有猪瘟病毒的溶液；CSFV内标：含CSFV内标RNA即序列如序列表中序列7所示的稀释物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；(2)核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μM，磁珠50-500mg/L；(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1％SDS，EDTA1-10mM；(4)CSFV反应液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10％，KCl5-40mM；(5)CSFV检测液：将CSFV扩增引物和CSFV检测探针溶解在TE溶液即10mMTris和1mMEDTA的混合液中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应；(6)S...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜德，孙洁，杨俊兴，花群义，于明辉，居金良，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31