一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组及试剂盒，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1:5’‑ACTTAGCCTAGCACCACAT‑3’,S2：5’‑CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG‑3’。本发明专利技术根据牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株之间的差异，即牛病毒性腹泻现地分离株存在612个核苷酸的缺失，设计特异性引物S1、S2，能够对牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株进行特异性扩增。本发明专利技术的专用试剂盒具有很强的敏感性、特异性，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达100％，能够广泛用于临床牛病毒性腹泻病毒疫苗和现地分离株的鉴别诊断。

Primer set and kit for differential diagnosis of bovine viral diarrhea virus isolates and vaccine strains

The present invention discloses a primer group and a kit for the differential diagnosis of the present isolation and vaccine strain of bovine viral diarrhoea virus. The primer groups include primers S1 and S2, which are S1:5 'ACTTAGCCTAGCACCACAT 3' and S2:5 'CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG 3'. According to the difference between the isolated strain of bovine viral diarrhea virus and the vaccine strain, that is, the absence of 612 nucleotides in the isolated strain of bovine viral diarrhea, the specific primers S1 and S2 are designed, which can specifically amplify the isolated strain of bovine viral diarrhea virus and the vaccine strain. The special kit of this invention has strong sensitivity and specificity, and the coincidence rate can reach 100% compared with the method of virus isolation and IFA, and can be widely used in the differential diagnosis of clinical bovine viral diarrhea virus vaccine and local isolated strain.

【技术实现步骤摘要】
一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组及试剂盒
本专利技术涉及兽医生物病毒检测
，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组及试剂盒。
技术介绍
牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheaVirus简写BVDV属于黄病毒科瘟病毒属)引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高，该病主要表现为牛呕吐、水样腹泻和脱水，给养殖业带来巨大的经济损失，是目前危害世界养牛业的重要疫病之一。我国与1986年首次成功分离到BVDV，该病毒广泛存在于我国的养牛场中，严重影响了养牛业的经济效益。近年发现BVDV在免疫压力下正在发生变异，原有的鉴别诊断BVDV疫苗毒株和分离株的方法难以满足实际需求，因此建立一种能够快速区分牛流行性腹泻疫苗毒株与现地分离株的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1：5’-ACTTAGCCTAGCACCACAT-3’；S2：5’-CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG-3’。一种所述的引物组在制备用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断试剂盒中的应用。一种所述的引物组的牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断试剂盒。所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、TaqDNA聚合酶和双蒸水。所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/LdNTP8.0μL、10mmol/LS1引物1.0μL、10mmol/LS2引物1.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。还包括对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析：当扩增片段为1472bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为疫苗株；当扩增片段大小为824bp，则样本中的牛病毒性腹泻病毒为现地分离株。所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。本专利技术的有益效果：本专利技术通过比对牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株的差异，发现牛流行性腹泻现地分离株存在核苷酸的缺失，设计特异性引物S1、S2，能够对牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒RNA，再使用S2引物反转录合成cDNA，并采用PCR方法鉴别检测牛病毒性腹泻病毒疫苗株与现地分离株，扩增疫苗株预期扩增片段大小为1472bp，扩增现地分离株预期片段大小为824bp。与现有技术相比，本专利技术的专用试剂盒具由很强的敏感性、特异性，对牛口蹄疫病毒、牛蓝舌病病毒、牛赤羽病病毒、牛阮病毒的扩增结果均为阴性，能够广泛用于临床牛病毒性腹泻病毒疫苗株和现地分离株的鉴别诊断。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。实施例1、鉴别诊断方法的构建1、引物设计设计两条特异性引物，具体如下:S1：5’-ACTTAGCCTAGCACCACAT-3’(SEQIDNO.1)S2：5’-CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG-3’(SEQIDNO.2)使用S1和S2进行PCR扩增，BVDV疫苗株预期扩增片段大小为1472bp，BVDV现地分离株预期扩增片段大小为824bp。2、病毒RNA的提取取BVDV毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，RNA存在于水相中；(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤RNA沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无RNAse水溶解RNA，即得到总RNA。3、反转录以步骤2提取的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA，反转录反应体系为：模板RNA4.9μLS2引物(10mmol/L)0.3μLRTase酶抑制剂(40U/μL)0.3μLM-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μL10×M-MLV缓冲液2.0μL反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。4、聚合酶链式反应(PCR)4.1PCR反应体系以步骤3获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：4.2PCR反应条件优化对BVDV疫苗株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行PCR反应扩增BVDV疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出1472bp大小的片段，与预期大小一致。对BVDV现地分离株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行PCR反应扩增BVDV现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现824bp大小的片段，与预期大小一致。综合上述反应，本专利技术最终将复合PCR的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物置于-20℃保存。5、电泳对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察结果。本专利技术的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。实施例2、BVDV疫苗株和BVDV现地分离株样品的鉴别诊断方法分别以BVDV疫苗株和BVDV现地分离株为样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2，其中：S1：5’‑ACTTAGCCTAGCACCACAT‑3’；S1：5’‑CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断的引物组，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2，其中：S1：5’-ACTTAGCCTAGCACCACAT-3’；S1：5’-CAATAAGCTTAGTCGACTGTATG-3’。2.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断试剂盒中的应用。3.一种包含如权利要求1所述的引物组的牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株鉴别诊断试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、TaqDNA聚合酶和双蒸水...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾云云，褚海侠，赵崇红，郭樊，
申请(专利权)人：贾云云，褚海侠，赵崇红，郭樊，
类型：发明
国别省市：广东,44