一种绿色荧光蛋白的融合表达方法技术

本发明专利技术涉及一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其中,通过使用PCI、CIA、醋酸钠进行洗脱，通过梯度离心除掉反应体系中的杂质。将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端，提高连接成功率。减少了测序操作由于杂质存在而影响测序的准确性。得到的DNA纯度较高。步骤操作简单，重现性好，试剂消耗少，降低实验成本，其电泳效果与试剂盒操作相当。

【技术实现步骤摘要】
一种绿色荧光蛋白的融合表达方法
本专利技术涉及基因工程中的DNA重组及操作，具体涉及一种绿色荧光蛋白的融合表达方法。
技术介绍
基因工程(geneticengineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。专利201710232127公开了一种绿色荧光蛋白偶联的琼脂糖的制备方法，以PCR的方式获得基因产物；201610942279.4公开了一种改良的绿色荧光蛋白表达载体及其构建方法，通过设计引物，选择酶切位点，PCR及酶切后获得新的表达载体；专利200910077103.7公开了融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用，通过PCR扩展和设计引物来构建表达载体；专利201611044468公开了一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，涉及将启动子优化的重组基因的导入；专利200910077103.7公开了一种融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用。以上相关的各个专利对于绿色荧光蛋白的酶切、连接、转质及测序等方面没有详细的论述。DNA的限制性酶切、精制、连接及转质等操作已经广泛应用于科学研究中，但是不同研究机构学者使用的方法也不尽相同。目前很多生化试剂厂家有专门的试剂盒进行销售，但是购买试剂盒价格较为昂贵。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，该操作方法成熟可靠，得到的DNA纯度较高，并且DNA连接成功率较高，实验重复性好。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案实现：一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其中具体包括以下步骤：1.绿色荧光蛋白酶切方法1)绿色荧光蛋白EcoRI酶酶切将绿色荧光蛋白、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA，保存到TE溶液中；2)绿色荧光蛋白HindIII酶酶切将上步获得的具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA溶液，灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再分别加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的目的DNA片段，保存到TE溶液中；2.表达载体酶切方法1)表达载体EcoRI酶酶切将表达载体、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，通过电泳确认酶切结果，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体，并保存在TE溶液中；2)表达载体HindIII酶酶切将上步得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体与灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的载体片段，保存在TE溶液中；3.CIAP处理将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端；4.目的DNA片段酶切后的精制CIAP处理处理后的目的DNA片段溶液用固相萃取小柱萃取，用洗脱溶液对目的DNA片段溶液进行洗脱，通过离心将目的DNA片段截留下来，保存在无核水中。与现有的技术相比，本专利技术的有益效果是：1.本专利技术通过使用PCI、CIA、醋酸钠进行洗脱，通过梯度离心除掉反应体系中的杂质。将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端，提高连接成功率10％-20％。减少了测序操作由于杂质存在而影响测序的准确性。得到的DNA纯度较高80％-90％。2.本专利技术步骤操作简单，重现性好，试剂消耗少，降低实验成本，其电泳效果与试剂盒操作相当。3.避免样品损失，便于后续电泳、westernblot、测序等操作。附图说明图1为实施例1测序图谱的一部分。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进一步说明：一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，具体包括以下步骤：1.绿色荧光蛋白酶切方法1)绿色荧光蛋白EcoRI酶酶切将绿色荧光蛋白、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min，得到具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA，保存到TE溶液中；2)绿色荧光蛋白HindIII酶酶切将上步获得的具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA溶液，灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热加热35-40℃，加热时间1-1.5h，再分别加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的目的DNA片段，保存到TE溶液中；2.表达载体酶切方法1)表达载体EcoRI酶酶切将表达载体、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，通过电泳确认酶切结果，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min，得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体，并保存在TE溶液中；2)表达载体HindIII酶酶切将上步得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体与灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心，离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的载体片段，保存在TE溶液中；3.CIAP处理将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端；1)将目的DNA片段溶液、无菌水、缓冲液、CIAP在水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，离心浓缩，保存在TE溶液中，离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min，；2)将载体片段溶液、无菌水、缓冲液、CIAP在水浴下加热35-40℃，加热时间1-1.5h，，离心浓缩，保存在TE溶液中；离心条件：离心温度3-5℃，离心机转数10000-14000rpm,离心时间5-10min；4.目的DNA片段酶切后的精制CIAP处理处理后的目的DNA片段溶液用固相萃取小柱萃取，用洗脱溶液对目的DNA片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其特征在于，其中具体包括以下步骤：(1)绿色荧光蛋白酶切方法1)绿色荧光蛋白EcoRI酶酶切将绿色荧光蛋白、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA，保存到TE溶液中；2)绿色荧光蛋白HindIII酶酶切将上步获得的具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA溶液，灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再分别加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的目的DNA片段，保存到TE溶液中；(2)表达载体酶切方法1)表达载体EcoRI酶酶切将表达载体、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热35‑40℃，加热时间1‑1.5h，通过电泳确认酶切结果，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体，并保存在TE溶液中；2)表达载体HindIII酶酶切将上步得到具有EcoRI酶酶切位点的表达载体与灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的载体片段，保存在TE溶液中；(3)CIAP处理将目的DNA片段和载体片段分别进行CIAP处理，使目的DNA片段和载体片段的末端成为粘性末端；(4)目的DNA片段酶切后的精制CIAP处理处理后的目的DNA片段溶液用固相萃取小柱萃取，用洗脱溶液对目的DNA片段溶液进行洗脱，通过离心将目的DNA片段截留下来，保存在无核水中。...

【技术特征摘要】
1.一种绿色荧光蛋白的融合表达方法，包括酶切、连接、转质及测序，其特征在于，其中具体包括以下步骤：(1)绿色荧光蛋白酶切方法1)绿色荧光蛋白EcoRI酶酶切将绿色荧光蛋白、灭菌水、缓冲液及EcoRI酶加入到离心管中，在水浴下加热，再依次加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别进行离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA，保存到TE溶液中；2)绿色荧光蛋白HindIII酶酶切将上步获得的具有EcoRI酶酶切位点的绿色荧光蛋白DNA溶液，灭菌水、缓冲液、HindIII酶进行水浴下加热，再分别加入溶液PCI、CIA、醋酸钠分别离心浓缩，去除溶液中多余的脂类、糖类杂质，得到具有EcoRI酶和HindIII酶两个酶切位点的目的DNA片段，保存到TE溶液中；(2)表达载体酶切方法1)表达载体EcoRI酶酶切将表达载体、灭菌水、缓冲液及Eco...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝晓亮，高云，全艳玲，王勇，费爱萍，方志刚，姜俊羽，马诗文，
申请(专利权)人：辽宁科技大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21