使用CRISPR核酸筛选细菌、古细菌、藻类和酵母的方法技术

本申请涉及使用CRISPR核酸来筛选细菌、古细菌、藻类和/或酵母中的必需基因和非必需基因以及可消耗基因组岛、来杀灭细菌、古细菌、藻类和/或酵母、来鉴定一种或多种基因的表型、和/或来筛选细菌、古细菌、藻类和/或酵母中的基因组大小减小和/或基因缺失。

Methods for screening bacteria, archaea, algae and yeast using CRISPR nucleic acid

This application involves the use of CRISPR nucleic acids to screen essential and non essential genes in bacteria, paleobacteria, algae and / or yeast, and to consume genome islands, to kill bacteria, palaeobacteria, algae and / or yeast, to identify the phenotypes of one or more genes, and / or to screen for bacteria, paleobacteria, algae and / or yeast. The size of the genome is reduced and / or gene deletion in the genome.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用CRISPR核酸筛选细菌、古细菌、藻类和酵母的方法优先权声明本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2015年5月29日提交的美国临时专利申请No.62/168,355和于2016年2月18日提交的美国临时专利申请No.62/296,853的权益，将这两个专利申请每一者的全部内容以引用的方式并入本文。
本申请涉及使用CRISPR核酸来筛选细菌、古细菌、藻类和/或酵母中的必需基因和非必需基因以及可消耗基因组岛、来杀灭细菌、古细菌、藻类和/或酵母、来鉴定一种或多种基因的表型、和/或来筛选细菌、古细菌、藻类和/或酵母中的基因组大小减小和/或基因缺失。
技术介绍
成簇的规律间隔的短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)与相关的序列(cas)一起构成了CRISPR-Cas系统，该系统在许多细菌中赋予获得性免疫力。CRISPR介导的免疫通过吸收来自侵入性遗传元件诸如质粒和噬菌体的DNA作为新“间隔区”来形成。CRISPR-Cas系统由被高变序列间隔开的短DNA重复的阵列组成，阵列侧接cas基因，该系统通过序列特异性的靶向和干扰，提供了对抗侵入性遗传元件的获得性免疫力(Barrangou等人，2007.Science.315:1709-1712；Brouns等人，2008.Science321:960-4；Horvath和Barrangou.2010.Science.327:167-70；Marraffini和Sontheimer.2008.Science.322:1843-1845；Bhaya等人，2011.Annu.Rev.Genet.45:273-297；Terns和Terns.2011.Curr.Opin.Microbiol.14:321-327；Westra等人，2012.Annu.Rev.Genet.46:311-339；BarrangouR.2013.RNA.4:267-278)。通常，侵入性DNA序列作为新的“间隔区”获得(Barrangou等人，2007.Science.315:1709-1712)，每个这种新“间隔区”与CRISPR重复配对并作为新的重复-间隔区单元插入CRISPR基因座中。随后，该重复-间隔区阵列转录为长的前CRISPRRNA(pre-crRNA)(Brouns等人，2008.Science321:960-4)，该前CRISPRRNA被加工成小的干扰性CRISPRRNA(crRNA)，其驱动序列特异性识别。具体而言，crRNA将核酸酶引向互补的靶标以进行由Cas核酸内切酶介导的序列特异性核酸切割(Garneau等人，2010.Nature.468:67-71；Haurwitz等人，2010.Science.329:1355-1358；Sapranauskas等人，2011.核酸Res.39:9275-9282；Jinek等人，2012.Science.337:816-821；Gasiunas等人，2012.Proc.Natl.Acad.Sci.109:E2579-E2586；Magadan等人，2012.PLoSOne.7:e40913；Karvelis等人，2013.RNABiol.10:841-851)。这种普遍的系统存在于几乎一半的细菌(～46％)和绝大部分古细菌(～90％)中。概括地说，存在两大类别(Makarova等人，NatRevMicrobiol.13:722–736(2015))的CRISPR-Cas系统，根据cas基因含量、cas操纵子结构、Cas蛋白序列以及加工步骤，这两种主要类别涵盖五种主要类型和16种不同的亚型(Makarova等人，BiolDirect.6:38(2011)；Makarova和KooninMethodsMolBiol.1311:47–75(2015)；Barrangou,R.基因组Biology16:247(2015))。在I型和III型中，专门的Cas内切核酸酶加工前crRNA，其然后组装成能够识别并切割与该crRNA互补的核酸的大的多Cas蛋白质复合体。I型系统是最常见和普遍的系统，其以级联驱动和PAM依赖的方式靶向DNA，从而通过利用标志蛋白(signatureprotein)Cas3破坏靶标核酸。在II型CRISPR-Cas系统中涉及不同的过程。这里，通过其中反式激活crRNA(tracrRNA)与crRNA的重复区杂交的机制对前CRNA进行加工。RNA酶III切割该杂交的crRNA-tracrRNA，接下来的第二个事件是移除每个间隔区的5'端，产生保持与tracrRNA和Cas9结合的成熟crRNA。该成熟复合体然后定位与该复合体中的间隔区序列互补的靶标dsDNA序列(“原间隔区(protospacer)”序列)并切开两条链。II型系统中的复合体进行的靶标识别和切割不仅需要crRNA-tracrRNA复合体上的间隔区序列与靶标“原间隔区”序列之间互补的序列，还需要位于原间隔区序列3'端的原间隔区相邻基序(protospaceradjacentmotif,PAM)序列。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供了一种针对必需基因、非必需基因和/或可消耗基因组岛对细菌细胞群体进行筛选的方法，包括：向所述细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，从而产生转化的细菌细胞的群体；确定所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中是否存在缺失，其中所述转化的细菌、古细菌或酵母细胞的群体中存在缺失意味着所述靶标区包含在非必需基因和/或可消耗基因组岛内，而所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中不存在缺失意味着所述靶标区包含在必需基因内。可用于本专利技术的CRISPR阵列可以是I型、II型、III型、IV型或V型CRISPR阵列。本专利技术的第二个方面提供了一种针对必需基因、非必需基因和/或可消耗基因组岛对细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体进行筛选的方法，包括：向所述细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体中引入(a)包含反式编码的CRISPR(tracr)核酸的异源核酸构建体，(b)异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的基因组(染色体和/或质粒)中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，和(c)Cas9多肽或包含编码Cas9多肽的多核苷酸的异源核酸构建体，从而产生转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体；以及确定所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中是否存在缺失，其中所述转化的细菌、古细菌或酵母细胞的群体中存在缺失意味着所述靶标区包含在非必需基因和/或可消耗基因组岛内，而所述转化的细菌、古细菌、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对必需基因、非必需基因和/或可消耗基因组岛对细菌细胞群体进行筛选的方法，包括：向所述细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复‑间隔区‑重复序列或至少一个重复‑间隔区序列，其中所述重复‑间隔区‑重复序列或所述至少一个重复‑间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，从而产生转化的细菌细胞的群体；以及确定所述转化的细菌细胞的群体中是否存在缺失，其中所述转化的细菌细胞的群体中存在缺失表明所述靶标区包含在非必需基因和/或可消耗基因组岛内，而所述群体中不存在缺失意味着所述靶标区包含在必需基因内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.29 US 62/168,355;2016.02.18 US 62/296,8531.一种针对必需基因、非必需基因和/或可消耗基因组岛对细菌细胞群体进行筛选的方法，包括：向所述细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，从而产生转化的细菌细胞的群体；以及确定所述转化的细菌细胞的群体中是否存在缺失，其中所述转化的细菌细胞的群体中存在缺失表明所述靶标区包含在非必需基因和/或可消耗基因组岛内，而所述群体中不存在缺失意味着所述靶标区包含在必需基因内。2.一种针对必需基因、非必需基因和/或可消耗基因组岛对细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体进行筛选的方法，包括：向所述细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体中引入(a)包含反式编码的CRISPR(tracr)核酸的异源核酸构建体，(b)异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的基因组(染色体和/或质粒)中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，和(c)Cas9多肽或包含编码Cas9多肽的多核苷酸的异源核酸构建体，从而产生转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体；以及确定所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中是否存在缺失，其中所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中存在缺失意味着所述靶标区包含在非必需基因和/或可消耗基因组岛内，而所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体中不存在缺失意味着所述靶标区包含在必需基因内。3.一种杀灭细菌细胞群体内的一种或多种细菌细胞的方法，包括：向所述细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列(crRNA、crDNA)，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，从而杀灭所述细菌细胞群体内包含所述靶标区的一种或多种细菌细胞。4.一种杀灭细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体内的一种或多种细胞的方法，包括：向所述细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体中引入(a)包含反式编码的CRISPR(tracr)核酸的异源核酸构建体，(b)包含CRISPR阵列的异源核酸构建体，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的基因组(染色体和/或质粒)中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，和(c)Cas9多肽和/或包含编码Cas9多肽的多核苷酸的异源核酸构建体，从而杀灭细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体内在其基因组中包含所述靶标区的一种或多种细胞。5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，所述靶标区在必需基因或非必需基因内。6.一种鉴定与细菌基因相关联的表型的方法，包括：向细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述至少一个重复-间隔区序列和所述重复-间隔区-重复序列的间隔区包含与所述群体中的细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，其中所述靶标区包含编码多肽或功能性核酸的开放阅读框的至少一部分，从而杀灭包含所述靶标区的细胞并产生不含所述靶标区的转化细菌细胞的群体；以及分析所述群体的表型。7.根据权利要求6所述的方法，包括在分析之前，从所述转化细菌细胞的群体培养独立的细菌集落；以及分析所述独立集落的表型。8.一种鉴定细菌、古细菌、藻类或酵母基因的表型的方法，包括：向细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体中引入(a)包含反式编码的CRISPR(tracr)核酸的异源核酸构建体，(b)包含CRISPR阵列的异源核酸构建体，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的基因组(染色体和/或质粒)中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，和(c)Cas9多肽和/或包含编码Cas9多肽的多核苷酸的异源核酸构建体，从而杀灭包含所述靶标区的细菌、古细菌或酵母细胞并产生不含所述靶标区的转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体；以及分析所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体的表型，和/或(i)由所述转化的细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的群体培养独立细菌、古细菌、藻类或酵母集落，以及(ii)分析所述独立集落的表型。9.根据权利要求1、3、6或7中任一项所述的方法，其中所述CRISPR阵列为I型、II型、III型、IV型、V型CRISPR阵列。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列包含与来自野生型I型CRISPR阵列、野生型II型CRISPR阵列、野生型III型CRISPR阵列、野生型IV型CRISPR阵列或野生型V型CRISPR阵列的重复相同的重复。11.根据权利要求2、4、5或8中任一项的方法，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列包含与来自野生型II型CRISPR阵列的重复相同的重复。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述靶标区是随机选择的或是特定选择的。13.根据权利要求12所述的方法，其中随机选择的靶标区选自与细菌、古细菌或酵母基因组中的PAM序列相邻的任意至少10个连续核苷酸。14.根据权利要求12所述的方法，其中特定选择的靶标区选自包含与细菌、古细菌、藻类或酵母基因组中的PAM序列相邻的至少10个连续核苷酸的基因、开放阅读框或推定的开放阅读框。15.根据权利要求2、4、5、8、11至14中任一项所述的方法，其中所述异源核酸构建体包含反式编码的CRISPR(tracr)核酸并且所述包含CRISPR阵列的异源核酸构建体包含在CRISPR向导结构(gRNA、gDNA)中，所述向导结构任选还包含具有编码Cas9多肽的多核苷酸的异源核酸构建体。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CRISPR向导结构与启动子有效连接。17.一种从细菌细胞群体中选择基因组大小减小的一个或多个细菌细胞的方法，包括：向细菌细胞群体中引入异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的一个或多个细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，其中杀灭包含所述靶标区的细胞，从而从所述细菌细胞群体中选择不含所述靶标区并且基因组大小减小的一种或多种细菌细胞。18.一种从细菌细胞群体中选择基因组大小减小的一种或多种细菌细胞的方法，包括：向细菌细胞群体中引入：(a)(i)一种或多种异源核酸构建体，所述构建体包含与所述细菌细胞的基因组中存在的至少300个连续核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸序列，或者(ii)两种或更多种异源核酸构建体，所述构建体包含至少一个转座子，从而产生转基因细菌细胞的群体，所述转基因细菌细胞在整合进所述基因组中的所述一种或多种异源核酸构建体与所述基因组中存在的所述至少300个连续核苷酸之间、或在整合进所述基因组中的第一转座子与第二转座子之间包含非天然的同源重组位点；和(b)异源核酸构建体，所述构建体包含CRISPR阵列，所述CRISPR阵列包含(5'至3')重复-间隔区-重复序列或至少一个重复-间隔区序列，其中所述重复-间隔区-重复序列或所述至少一个重复-间隔区序列的间隔区包含与所述群体中的一种或多种细菌细胞的基因组中的靶标区实质上互补的核苷酸序列，其中所述靶标区位于引入进所述基因组中的所述一种或多种异源核酸构建体与所述基因组中存在的所述至少300个连续核苷酸之间和/或位于所述第一转座子与所述第二转座子之间，以及杀灭包含所述靶标区的细胞，从而从所述转基因细菌细胞群体中选择不含所述靶标区并且基因组大小减小的一种或多种细菌细胞。19.一种从细菌、古细菌、藻类或酵母细胞群体中选择基因组大小减小的一种或多种细菌、古细菌、藻类或酵母细胞的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·巴伦古，K·M·泽勒，
申请(专利权)人：北卡罗来纳州立大学，
类型：发明
国别省市：美国,US