用剪接转换寡核苷酸靶向KIT诱导肥大细胞凋亡制造技术

提供了用于调节Kit生物活性的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开的主题提供了具有10‑50个连接的核苷酸的反义寡聚体，其中该反义寡聚体靶向编码Kit的pre‑mRNA的区域，并且进一步地，其中靶向的区域包括涉及编码Kit的pre‑mRNA的剪接的序列。还提供了编码本文公开的反义寡聚体的表达载体，本公开的反义寡聚体的吗啉代寡聚体衍生物，包括本公开的反义寡聚体、表达载体和/或吗啉代寡聚体的药物组合物，以及用于调节细胞和/或组织中的Kit pre‑RNA的剪接的方法，诱导肥大细胞凋亡，并治疗与Kit表达相关的疾病、病症和/或病况。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用剪接转换寡核苷酸靶向KIT诱导肥大细胞凋亡相关应用本申请要求于2018年8月27日提交的美国临时专利申请序列号62/723,326的优先权和权益；该申请的公开内容通过引用以其整体结合于本文中。资助声明本专利技术是在NationalInstitutesofHealth授予的资助号为P30ES025128和T32OD011130的政府支持下完成。该政府拥有本专利技术的某些权利。
在一些实施方式中，本文公开的主题涉及采用剪接转换寡核苷酸(spliceswitchingoligonucleotides)靶向Kit基因产物以诱导肥大细胞凋亡，该Kit基因产物包括但不限于从Kit基因组基因座转录的RNA转录物(transcript)。在一些实施方式中，本公开的主题涉及用于选择性靶向肥大细胞和Kit相关肿瘤性疾病的应用。
技术介绍
c-Kit是一种在物种之间高度保守的原癌基因(proto-oncogene)，并编码受体酪氨酸激酶Kit(也称为CD117和/或肥大/干细胞生长因子受体(SCFR))。Kit在骨髓源造血干细胞(包括肥大细胞(MC)祖细胞)的增殖、存活和分化中起作用(在Pittonietal.,2011中综述)。Kit在大多数造血细胞中的表达会在分化期间丢失，但MC在其整个生命周期中都会保留Kit表达，而Kit信号传导对于MC的生存和增殖仍然至关重要(TsaiMetal.,1991；Mekorietal.,1993；Iemuraetal.,1994；Gallietal.,1995)。当发现c-Kit的病毒对应物v-Kit引起Hardy-ZuckermanIV猫肉瘤病毒的转化活性时，c-Kit才开始实现其致癌潜力(Besmeretal.,1986)。随后，激活的功能获得性c-Kit突变与几种人类恶性肿瘤的发生和发展相关，在胃肠道间质瘤(GIST)和MC增生性疾病如肥大细胞增多症和MC白血病中的发生率特别高(在Cruseetal.,2014中综述)。肥大细胞增多症(mastocytosis)是一组罕见而异质性肿瘤疾病群，其特征在于MC的异常扩增和积累(Valentetal.,2017)。由于肥大细胞亚型的广泛生物学异质性，因此该病可能难以治疗，所有这些均以MC的肿瘤生长为特征，但会表现出独特的临床表现和治疗响应(Valentetal.,2017)。当前治疗肥大细胞增多症和Kit-驱动的瘤形成的一线治疗方法包括化学疗法和酪氨酸激酶抑制剂(TKI；Gleixneretal.,2006；Gotlibetal.,2016)。然而，这些治疗方法并不总是对完全缓解或改善预后少见的晚期疾病有效。而且，由于化学疗法和TKI的非特异性，存在脱靶毒性的高风险(Jensenetal.,2008)。因此，在本领域中仍然需要开发出具有更好安全特性的Kit-特异性治疗方法。Kit基因产物与癌症发展和异常的MC增长密切相关，代表了所需的且具有挑战性的治疗目标。位于人类染色体4q12上的人类c-Kit(Giebeletal.,1992)包含21个外显子，且易受一系列突变的影响。这其中临床上最重要的是功能获得性突变，该突变会赋予受体构象变化，并使酪氨酸激酶活性独立于Kit配体—干细胞因子(SCF)(Cruseetal.,2014；Arocketal.,2015综述)。野生型Kit由不同的结构域组成，包括SCF结合细胞外结构域、跨膜结构域、自抑制近膜(juxtamembrane)结构域和两个细胞内酪氨酸激酶结构域，它们能够自磷酸化(Cruseetal.,2014；Arocketal.,2015)。在正常情况下，Kit-SCF相互作用对于MC的存活、增殖和分化是必需的，但是在存在激活突变的情况下，SCF依赖性消失，致癌性Kit信号传导驱动肿瘤MC的生长。尽管已知整个Kit基因都发生突变，但许多都聚集于与不同的疾病有关的热点上(Cruseetal.,2014)。例如，编码Kit的近膜结构域的外显子11中的突变通常发生于GIST中(Taniguchietal.,1999；Miettinenetal.,2002)，而编码第二激酶结构域的外显子17中的D816V点突变却在大多数患有系统性肥大细胞增多症的患者中检测到(Arocketal.,2015)。鉴定出患者突变对于评价疾病预后和确定治疗方法很重要，因为突变的类型和其他突变的发生决定了Kit相关恶性肿瘤治疗的成功。具体而言，在超过80％的成人系统性肥大细胞增多症病例中发现的错义突变D816V(Arocketal.,2015)，会导致Kit构象变化，从而使其对靶向Kit失活ATP结合位点构象的TKI如甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)产生抗性(Gleevec；Maetal.,2002；Pardananietal.,2003)。由于在与Kit相关的恶性肿瘤中c-Kit突变的异质性和在某些实施方式中本文公开的赋予TKI抗性的突变的出现，是靶向Kit表达作为治疗方法的组合物和方法。由于标准siRNA方法在沉默Kit中效率低下(Wuetal.,2012；Yangetal.,2015)，特别是在体内，因此在本公开主题的一些实施方式中，会诱导pre-mRNA异常剪接(如但不限于，外显子跳跃(exonskipping))的化学上稳定的反义寡核苷酸(ASO)被用于改变c-Kit基因产物的表达。在本公开主题的示例性实施方式中，称为KitStop的外显子跳跃寡核苷酸(ESO)通过将移码(框移，读框移位，frameshift)引入成熟c-KitmRNA转录物中而靶向c-Kit表达。这导致立即的STOP密码子和功能丧失。KitStop下调MC中的野生型和突变型Kit的表达，从而阻止增殖并诱导体外快速细胞死亡。KitStopESO给药于腹膜腔或皮肤中显著减少体内这些组织中的MC数量。这些数据表明，KitStopESO能够损耗动物体内的MC，并充当与Kit相关的恶性肿瘤的治疗实用性的原理证明。鉴于食品和药物管理局最近批准了ESOeteplirsen用于治疗Duchenne肌营养不良症(DMD；Dowling,2016；Syed,2016)，本公开的主题则会提供靶向Kit的治疗药物。
技术实现思路
本内容列出了本公开的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和置换。本内容仅仅是众多和变化的实施方式的举例说明。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是举例说明性的。这种实施方式通常能够具有或不具有所提到的特征；同样，这些特征能够应用于本公开的主题的其他实施方式，而不管是否在本内容中列出。为避免过多重复，本内容未列出或建议此类特征的所有可能组合。在一些实施方式中，本公开的主题提供了包含10-50个连接的核苷酸的反义寡聚体，其中反义寡聚体靶向编码Kit的pre-mRNA的区域，并且进一步地，其中靶向的区域(靶标区域，目标区域，targetedregion)包括涉及编码Kit的pre-mRNA的剪接的序列。在一些实施方式中，反义寡聚体与编码Kit的pre-mRNA的杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含10-50个连接的核苷酸的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体靶向编码Kit的pre-mRNA的区域，并且其中靶向的区域包括与所述编码Kit的pre-mRNA的剪接有关的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180827 US 62/723,3261.一种包含10-50个连接的核苷酸的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体靶向编码Kit的pre-mRNA的区域，并且其中靶向的区域包括与所述编码Kit的pre-mRNA的剪接有关的序列。


2.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与所述编码Kit的pre-mRNA的杂交改变所述pre-mRNA的剪接。


3.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与所述编码Kit的pre-mRNA的杂交降低Kit蛋白的表达。


4.根据权利要求3所述的反义寡聚体，其中表达降低的所述Kit蛋白是野生型Kit蛋白或突变Kit蛋白。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的反义寡聚体，其中所述靶向的区域包含选自由以下各项组成的组的多核苷酸序列的至少一部分：内含子序列、外显子序列、包含内含子/外显子连接的序列、剪接供体序列、剪接受体序列、剪接增强子序列、剪接分支点序列或聚嘧啶束。


6.根据权利要求5所述的反义寡聚体，其中所述多核苷酸序列与选自由Kit外显子2-20组成的组的Kit外显子相关，所述Kit外显子为例如但不限于外显子4剪接供体序列。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的反义寡聚体，其中所述编码Kit的pre-mRNA是由c-Kit基因转录而来。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的反义寡聚体，其中Kit蛋白选自由人KIT蛋白、鼠Kit蛋白、犬Kit蛋白、猫Kit蛋白和马Kit蛋白组成的组。


9.根据权利要求7所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与c-Kitpre-mRNA的杂交致使产生缺少外显子4的至少一部分的成熟c-KitmRNA分子。


10.根据权利要求8所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与c-Kitpre-mRNA的杂交致使产生编码短截Kit蛋白的mRNA分子。


11.根据权利要求1所述的反义寡聚体，其中所述10-50个连接的核苷酸包含与所述编码Kit的pre-mRNA中的靶标核酸序列充分互补的靶向核酸序列，使得寡核苷酸与靶标序列特异性杂交。


12.根据权利要求11所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与所述编码Kit的pre-mRNA的杂交改变所述pre-mRNA的剪接。


13.根据权利要求11所述的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体与编码Kit的pre-mRNA的杂交降低Kit蛋白的表达。


14.根据权利要求13所述的反义寡聚体，其中表达降低的所述Kit蛋白是野生型Kit蛋白或突变Kit蛋白。


15.根据权利要求13所述的反义寡聚体，其中靶向序列包含与所述靶标序列中的至少6个连续核碱基完全互补的至少6个连续核碱基。


16.根据权利要求11所述的反义寡聚体，其中靶向序列在其整个长度上与所述靶标序列中相似大小的连续核碱基序列至少80％互补。


17.根据权利要求11-16中任一项所述的反义寡聚体，其中所述靶标序列包含选自由以下各项组成的组的多核苷酸序列的至少一部分：内含子序列、外显子序列、包含内含子/外显子连接的序列、剪接供体序列、剪接受体序列、剪接增强子序列、剪接分支点序列或聚嘧啶束。


18.根据权利要求17所述的反义寡聚体，其中所述多核苷酸序列与选自由Kit外显子2-20组成的组的Kit外显子相关，所述Kit外显子为例如但不限于外显子4剪接供体序列。


19.根据权利要求11-18中任一项所述的反义寡聚体，其中所述编码Kit的pre-mRNA是由c-Kit基因转录而来。


20.根据权利要求11-19中任一项所述的反义寡聚体，其中Kit蛋白选自由人Kit蛋白、鼠Kit蛋白、犬Kit蛋白、猫Kit蛋白和马Kit蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：格伦·P·克鲁斯，
申请(专利权)人：北卡罗来纳州立大学，
类型：发明
国别省市：美国;US