本发明专利技术公开了检测柯萨奇病毒A组6型(CV‑A6)中和抗体的检测方法及所应用的重组病毒。本发明专利技术利用2种重组质粒包装的假病毒系统检测中和抗体，由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。经过多个试验，其结果表明该发明专利技术中所陈述的假病毒检测系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测CV‑A6中和抗体的方法。基于以上特点，该假病毒检测系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于CV‑A6病毒疫苗的研制及检测患者个人及人群CV‑A6特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测柯萨奇病毒A组6型中和抗体的方法及其所应用的重组病毒
本专利技术属于生物
，尤其涉及检测柯萨奇病毒A组6型中和抗体的检测方法及其专用假病毒，具体涉及用于包装专用假病毒的两种重组质粒、制备该质粒的方法、专用假病毒及快速检测试剂盒。
技术介绍
：柯萨奇病毒A组6型(CoxsackievirusA6，CV-A6)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)。CV-A6为单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径约为30mm，无包膜和突起。CV-A6基因组全长约7400bp，基因组由一个开放阅读框及2个非编码区(5’-UTR和3’-UTR)构成。开放阅读框架为2202个氨基酸组成的多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为3个前体蛋白(P1、P2、P3)，其中P1前体蛋白编码4个病毒衣壳蛋白(VP1-VP4)，P2和P3编码7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D)。自2008年芬兰首次报道CV-A6引起手足口病流行以来，欧洲、亚洲以及南美洲等开始相继报道CV-A6相关手足口病的暴发。近几年，CV-A6呈全球流行趋势，尤其是太平洋地区，包括在中国、中国台湾、日本和新加坡等，CV-A6已经取代肠道病毒A组71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A组16(CV-A16)型成为引起手足口病的主要病原体。CV-A6不仅易感染儿童，也可引起健康成年人患病。CV-A6感染引起的临床症状除发热、咽痛及手、足、口皮肤黏膜疱疹等典型手足口病症状外，更易出现非典型疱疹、脱甲症、疱疹性咽颊炎及附睾炎等非典型手足口病症状。此外还有报道表明，近期流行的CV-A6感染可导致严重的中枢神经系统(CNS)急性并发症，如无菌性脑膜炎和脑干脑炎等。中和抗体的检测对CV-A6流行病学调查研究以及疫苗研发评价有很重要的意义。目前常用的金标准肠道病毒中和抗体效价方法为基于活病毒的细胞病变(cytopathiceffect,CPE)中和试验[ChonmaitreeT,FordC,SandersC,LuciaHL.Comparisonofcellculturesforrapidisolationofenteroviruses.JClinMicrobiol.1988Dec；26(12):2576-80.]，即通过观察中和抗体中和病毒后的细胞病变程度来判定血清中和抗体的水平。该方法结果可靠，缺点是活病毒在传代过程中易发生抗原漂移，更重要的是在试验操作过程中有危险性，因此对于技术人员的操作和安全设备都要求较高。而且操作繁琐，观察细胞病变需要时间较长，结果判读受主观因素影响较大，并且只能得到半定量的检测结果。本专利技术利用CV-A6的假病毒系统检测中和抗体的方法，采用了单周期感染的假病毒系统，所以没有使用活病毒时的安全问题。该假病毒检测系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。适合于快速、规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群CV-A6特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。
技术实现思路
：本专利技术一方面提供了一种用于包装柯萨奇病毒A组6型(CoxsackievirusA6，CV-A6)假病毒的重组表达质粒、组装成的假病毒和由此制备的试剂盒，以及使用该质粒、假病毒或该试剂盒检测CV-A6中和抗体的所述重组表达质粒命名为pEGFP-CV-A6-capsid质粒，表达质粒的氨基酸序列为SEQIDNo.1或在SEQIDNo.1的氨基酸和/或羧基端添加或缺失若干氨基酸后得到的与SEQIDNo.1具有相同或相似功能的序列。pEGFP-CV-A6-capsid质粒使用绿色荧光蛋白报告基因，该报告基因核苷酸序列为SEQIDNO：2所示的DNA序列。所述SEQIDNO：2第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3339位为CV-A6所有结构蛋白的编码基因。本专利技术的另一个方面，提供一种构建pEGFP-CV-A6capsid重组质粒的方法，包含以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-A6结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端；3)设计引物；所述引物序列为：IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGIF-pcDNA6-CA6-VP1-R:GGTGATGATGACCGGTTTAAGATGTTCTTTGTGGGCTTGOL-GFP-AITTL-VP4-R:CTTGGGCGCCAAGGGTAGTAATGGCCTTGTACOL-AITTL-CA6-VP4-F:GGCCATTACTACCCTTGGCGCCCAAGTTTCAAC在一些优选的实施方案中，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因；在另一些实施方案中，所有结构蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：1)其核苷酸序列为序列表中序列第733位到3339位所示；2)在严格条件下与1)所示的基因杂交且编码所述结构蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述结构蛋白的基因。本专利技术的另一个方面，提供一种检测CV-A6中和抗体的重组表达子质粒，重组表达子质粒命名为pCV-A16-replicon，表达子质粒的核苷酸序列为SEQIDNO：3或在SEQIDNO：3上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQIDNO：3具有相同或相似功能的序列。所述pCV-A16-replicon复制子的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因。所述SEQIDNO：3第1位到745位为CV-A16的5’UTR核苷酸序列；第746位到2395位为萤火虫荧光素酶基因的核苷酸序列；第2396位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6549位为CV-A16非结构蛋白的编码基因。本专利技术的另一个方面，提供一种构建pCV-A16-replicon重组表达子质粒的方法，包含以下步骤：1)用萤火虫荧光素酶的基因序列替换CV-A16结构蛋白的基因序列；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入萤火虫荧光素酶基因的C末端；3)将T7promoter序列引入至5’UTR前端；4)设计引物；所述引物序列为：IF-NotI-T7-CA16-F:TCAAGAATTGCGGCCGCGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGOL-CA16-5’UTR-luc-R:CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATTTCTTACAGTTAAGGAGCAATATATAATTAAGFL-luc-F：ATGGAAGACGCCAAAAACFL-luc-R：CAATTTGGACTTTCCGCCOL-CA16-luc-KITTL-2A-F:GGGCGGAAAGTCCAAATTGAAGATCACAACATTGGGAAAGIF-SalI-EV-dT25-R:CATGAGAATTGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT在一些优选的实施方案中，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因在本专利技术的一个方面，提供上述结构蛋白重组表达质粒或由此制备的试剂盒本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于包装柯萨奇病毒A组6型重组假病毒的重组表达子质粒和重组复制子质粒。其特征在于：所述重组表达子质粒命名为pEGFP‑CV‑A6‑capsid，表达质粒的氨基酸序列为SEQ ID No.1或在SEQ ID No.1的氨基酸和/或羧基端添加或缺失若干氨基酸后得到的与SEQ ID No.1具有相同或相似功能的序列；所述重组复制子质粒命名为pCV‑A16‑replicon，复制子质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO：3或在SEQ ID NO：3上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQ ID NO：3具有相同或相似功能的序列。
【技术特征摘要】
1.用于包装柯萨奇病毒A组6型重组假病毒的重组表达子质粒和重组复制子质粒。其特征在于：所述重组表达子质粒命名为pEGFP-CV-A6-capsid，表达质粒的氨基酸序列为SEQIDNo.1或在SEQIDNo.1的氨基酸和/或羧基端添加或缺失若干氨基酸后得到的与SEQIDNo.1具有相同或相似功能的序列；所述重组复制子质粒命名为pCV-A16-replicon，复制子质粒的核苷酸序列为SEQIDNO：3或在SEQIDNO：3上添加、缺失或突变若干个氨基酸后得到的与SEQIDNO：3具有相同或相似功能的序列。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid使用绿色荧光蛋白报告基因，氨基酸序列为SEQIDNO：4所示的氨基酸序列；所述重组复制子质粒pCV-A16-replicon的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因。3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsidSEQIDNO：2第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3339位为CV-A6所有结构蛋白的编码基因；所述重组复制子质粒pCV-A16-repliconSEQIDNO：3第1位到745位为CV-A16的5’UTR核苷酸序列；第746位到2395位为萤火虫荧光素酶基因的核苷酸序列；第2396位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6549位为CV-A16非结构蛋白的编码基因。4.一种表达权利要求1所述重组质粒的构建方法，其特征在于，所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid包含以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-A6所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端；3)设计引物；所述引物序列为：IF-pcDNA6-GFP-F:ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGIF-pcDNA6-CA6-VP1-R:GGTGATGATGACCGGTTTAAGATGTTC...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴星，苏瑶，梁争论，陈盼，董方玉，孙世洋，毛群颖，高帆，卞莲莲，姜崴，胡亚林，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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