用于生成单克隆抗体的方法和试剂技术

在一个实施方案中，本发明专利技术涉及用于生成特异性结合抗原的单克隆抗体的方法。本发明专利技术可以从多克隆抗体群体诸如非特异性多克隆群体或特异性结合抗原的多克隆抗体群体开始。本方法包括获得编码来自动物的多种免疫球蛋白的重链和轻链免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸分子；获得特异性结合所选抗原的多克隆免疫球蛋白群体的肽片段的质谱信息；将多克隆免疫球蛋白的肽片段的质谱信息与核酸序列编码的预测氨基酸序列的预测质谱信息相比较和/或关联，并且然后装配重链和轻链以产生特异性结合抗原的抗体(或其可变区)。

【技术实现步骤摘要】
用于生成单克隆抗体的方法和试剂本案是与母案专利技术名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201280021326.1，国际申请号是PCT/US2012/028501，申请日是日。交叉引用相关申请本申请主张2011年3月9日提交的美国临时申请号61/450,922、2011年11月15日提交的美国临时申请号61/560,006、2011年12月5日提交的美国临时申请号61/566,876和2012年2月3日提交的美国临时申请号61/594,729的优先权，其中每个申请的完整内容通过引用并入本文。专利
本公开涉及生物学，更具体地，涉及分子生物学和免疫学。专利技术背景抗体是生物学和商业上重要的多肽，其以高特异性和亲和力结合至被称为抗原的特定的目标分子。抗体由脊椎动物的免疫细胞产生，并且所有天然存在的抗体共有相同的基本结构，即两条相同的重链和与之共价结合的两条相同的轻链。单一重链和单一轻链的N-末端区域形成对于各单独抗体特有的抗原结合位点。重链的C-末端区域决定抗体的特定同种型，且相同的抗体产生细胞可以产生不同同种型的抗体，其中由细胞产生的所有抗体具有相同的抗原结合位点。不同同种型通常在动物中行使不同的功能。例如，E同种型的抗体(即IgE抗体)参与过敏性应答，而A同种型的抗体(即，IgA抗体)可以存在于粘膜、唾液和母乳中。四条链的抗体分子可以自身存在(例如IgG抗体)，或与额外单体存在以形成二聚物(例如，IgA抗体)或者甚至五聚体(例如，IgM抗体)。在很好理解抗体的基本结构的情况下，可以通过使用标准的分子生物学技术操作抗体的不同区域而产生重组抗体。例如，美国专利号6,180,370和6,548,640(完整地通过引用并入本文)描述了通过使用分子生物学技术操作非人抗体的各区域而使在非人动物中天然存在的抗体人源化。描述了使用标准的分子生物学技术用于操作或产生重组抗体的其他方法(参见，例如，PCT公开号WO91/17271、PCT公开号WO92/01047；美国专利号5,969,108、6,331,415、7,498,024、和7,485,291,其中所有都完整地通过引用并入本文)。在免疫应答过程中，动物将产生许多不同的抗体，每种具有不同的抗原结合特异性。抗体的该群体被称为抗体的多克隆群体。如果免疫应答针对特定抗原，则由动物产生的大多数(但不是所有)的多克隆抗体特异性结合该抗原。然而，由于对抗原的结合亲和力和结合位点上的差异，一些多克隆抗体比其他多克隆抗体更有利。在其1975年赢得诺贝尔奖的发现中，Kohler和Milstein发现了从产生多克隆抗体的动物分离和永生化单一抗体生成细胞的方法，所述单一抗体生成细胞产生特异性结合目标抗原的单克隆抗体(Kohler和Milstein,Nature256:495-497,1975)。该永生化技术(其包括将抗体产生细胞与永生化细胞融合产生产生单克隆抗体的杂交瘤)在过去35年已经是制备单克隆抗体的行业标准。尽管其具有广泛性和长久性，但是Kohler和Milstein杂交瘤方法具有许多缺点。例如，它非常费时费力。更贴切地，鉴于它是如何费时费力，只有一小部分动物的抗体产生细胞得到永生化且针对其产生特异性结合抗原的抗体的能力得到筛选。最后，哪怕只要一次分离具有所需抗原特异性的杂交瘤，但是获得抗体的氨基酸序列以促进抗体的进一步操作，诸如人源化，是费力费时的。存在对于生成特异性结合所需抗原的单克隆抗体的改进方法的需要。专利技术概述本专利技术的各个方面和实施方案提供了迅速且准确生成特异性结合目标抗原的单克隆抗体的方法和系统。在进一步方面和实施方案中，本专利技术提供了用于进行本专利技术的各种方法的试剂和组合物，和由进行本专利技术的各种方法产生的试剂和组合物。在一些实施方案中，本文公开的方法、试剂和组合物可用于从受试者的循环中生成单克隆抗体。在一个方面，本专利技术提供了用于获得特异性结合抗原的免疫球蛋白(或其可变区)的序列的方法，其包括：(a)提供编码至少一种动物的多种免疫球蛋白的免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸序列；(b)获得特异性结合抗原的多克隆免疫球蛋白群体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的肽片段的质谱信息；(c)将肽片段的质谱信息与核酸序列的预测质谱信息(所述预测质谱信息源自所述核酸序列的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列)相关联，以鉴定编码包含所述肽片段的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列；和(d)基于所述肽片段对所述免疫球蛋白链或其片段的氨基酸序列覆盖率从鉴定的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列或氨基酸序列中选择，以获得特异性结合抗原的免疫球蛋白的重或轻链的核苷酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，装配步骤(d)中选择的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(或其可变区)以生成特异性结合抗原的免疫球蛋白(或其可变区)。在一些实施方案中，在装配前，通过重组分子生物学技术或基因合成技术合成步骤(d)中获得的免疫球蛋白链可变区的核苷酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：用免疫测定筛选生成的免疫球蛋白(或其可变区)，以确认所述免疫球蛋白(或其可变区)特异性结合抗原。在一些实施方案中，免疫测定选自流式细胞术测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹测定、免疫组织化学测定、免疫荧光测定、放射免疫测定、中和测定、结合测定、亲和力测定、或蛋白或肽免疫沉淀测定。在一些实施方案中，基于所述肽片段对一部分链(例如，可变区或互补决定区)的氨基酸序列覆盖率进行步骤(d)中的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的选择。在其他实施方案中，基于所述肽片段对免疫球蛋白链或其片段的氨基酸序列覆盖率组合至少一种参数进行步骤(d)中的免疫球蛋白重链或轻链的选择，所述参数选自绘制的独特肽数目、谱共享、总肽计数、独特肽计数、编码核酸序列的频率和克隆相关性。在各个实施方案中，核酸序列和源自核酸序列的信息(包括，例如，核苷酸序列、预测的氨基酸序列、和预测的质谱)位于遗传物质数据库中。在一些实施方案中，由其获得核酸序列的动物是暴露于抗原的动物。在一些实施方案中，由编码来自动物的多种免疫球蛋白的免疫球蛋白链(或其可变区)的所述核酸序列编码的预测的氨基酸序列通过以下方式获得：(1)从来自所述动物的白血细胞分离核酸分子；(2)使用对于在所述编码免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸分子邻近的多核苷酸序列特异性的引物扩增编码免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸分子；(3)获得编码来自所述动物的多种免疫球蛋白的免疫球蛋白链(或其可变区)的所述扩增的核酸分子的核苷酸序列；和(4)使用遗传密码来将核苷酸序列翻译成预测的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸序列是表达的核酸序列(例如，在动物细胞中转录成RNA和/或翻译成蛋白)。在一些实施方案中，由编码来自动物的多种免疫球蛋白的免疫球蛋白链(或其可变区)的所述核酸分子编码的预测的氨基酸序列通过以下方式获得：(1)从来自所述动物的白血细胞分离核酸分子；(2)使用对于在所述编码免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸分子邻近的多核苷酸序列特异性的引物对编码免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸分子进行测序，以获得编码来自所述动物的多种免疫球蛋白的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列；和(3)使用遗传密码来将核酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于获得特异性结合抗原的免疫球蛋白的重链或轻链的核苷酸序列或氨基酸序列的方法，其包括：(a) 提供编码至少一种动物的免疫球蛋白链或其可变区的核酸序列；(b) 获得特异性结合抗原的多克隆免疫球蛋白群体，并且获得所述群体的重链或轻链或其可变区的肽片段的质谱信息；(c) 将所述肽片段的质谱信息与从所述核酸序列预测的质谱信息相关联，以鉴定包含所述肽片段的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列或氨基酸序列，其中所述预测质谱信息源自所述核酸序列编码的预测氨基酸序列；和(d) 基于所述肽片段对所述免疫球蛋白链或其片段的氨基酸序列覆盖率从鉴定的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列或氨基酸序列中选择，以获得特异性结合抗原的免疫球蛋白的重链或轻链的核苷酸序列或氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2011.03.09 US 61/450922;2011.11.15 US 61/560006;201.用于获得特异性结合抗原的免疫球蛋白的重链或轻链的核苷酸序列或氨基酸序列的方法，其包括：(a)提供编码至少一种动物的免疫球蛋白链或其可变区的核酸序列；(b)获得特异性结合抗原的多克隆免疫球蛋白群体，并且获得所述群体的重链或轻链或其可变区的肽片段的质谱信息；(c)将所述肽片段的质谱信息与从所述核酸序列预测的质谱信息相关联，以鉴定包含所述肽片段的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列或氨基酸序列，其中所述预测质谱信息源自所述核酸序列编码的预测氨基酸序列；和(d)基于所述肽片段对所述免疫球蛋白链或其片段的氨基酸序列覆盖率从鉴定的免疫球蛋白链(或其可变区)的核苷酸序列或氨基酸序列中选择，以获得特异性结合抗原的免疫球蛋白的重链或轻链的核苷酸序列或氨基酸序列。2.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)的至少一种动物是暴露于所述抗原的动物。3.权利要求1的方法，其中所述核酸序列是表达的核酸序列。4.权利要求1的方法，其中所述编码免疫球蛋白链(或其可变区)的核酸序列通过以下从所述至少一种动物获得：(1)从来自所述至少一种动物的白血...

【专利技术属性】
技术研发人员：R波拉基维奇，WC钟，JE拉什，SA博索莱尔，
申请(专利权)人：细胞信号科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US