一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法，包括：将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法
本专利技术属于生物分析、药学分析和免疫检测领域，具体涉及一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法。
技术介绍
艾塞那肽(Exendin-4)是一种GLP-1类似物，它的发现源于对一种毒蜥蜴的研究，该动物每年进食4次，断食期间，胰腺关闭，停止分泌胰岛素，与该物质有关。后来的研究表明Exendin-4的作用几乎与GLP-1的作用完全一致，Exendin-4也可通过GLP-1受体产生作用，又称为GLP-1受体激动剂，但对受体的亲和力还要强于GLP-1。并且Exendin-4的N端不易被DPP-IV降解，具有更长的血浆半衰期，具有良好的临床应用价值并给2型糖尿病的治疗提供了思路。许多药企纷纷开展研制Exendin-4相关生物治疗性产品用于临床II型糖尿病的治疗，并不断改进相关产品的研发。因此，对于Exendin-4的检测与分析方法的改进与提高，对于不断改进和更新中Exendin的各种形式的检测尤为重要。尤其是一个能通用的，高灵敏的检测方法能为Exendin相关的药学研究及应用中的检测和生物分析提供便利。Exendin-4是一个由39个氨基酸组成的多肽类物质，一般以人工合成为主。因其在2型糖尿病治疗中具有很强的优势，引起企业及科研院所的竞相开发。因而，针对艾塞那肽的检测方法也引起广大科研工作者的不断探索与更新，目前已经形成了多种多样的基于艾塞那肽的检测方法。如毛细管电泳法【宫菲菲，张玉芬，孙雯，等.毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度及在稳定性研究中的应用】,高效液相色谱法【吴宏斌，王永智，饶玲，等.高效液相色谱法测定重组艾塞那肽纯度的方法验证研究】，串联质谱法【盖云云，孙渝，李静，等.TSQVantage质谱仪测定两种多肽类药物戈舍瑞林和艾塞那肽】及ELISA法。不同的艾塞那肽检测方法可以应用到不同用途的检测中。像毛细管电泳及高效液相法用于工艺方面的纯度鉴定比较具有实际价值，因为其检测的下限浓度比较高，不太适用于浓度方面的定量检测；液质联用法在小分子化合物检测方面占据优势，但在分子量偏大，尤其是大于2000道尔顿的分子，其不具有基于抗原抗体即ELISA法的检测优势，尤其是对于蛋白、多肽类分子。虽然现在有公司推出TSQ等对蛋白、多肽类检测进行优化升级的仪器系统，但适用性以及普及性还不是很强，且这样的仪器价格非常昂贵，检测灵敏度仍然受限，像针对含39个肽的艾塞那肽来说还是有其局限性，其对血液的样品前处理过程复杂。传统的常见的夹心ELISA法在多肽检测方面仍有其优势，但在检测灵敏度等方面需要进一步升级。灵敏度问题是许多检测方法关心的一个关键问题，因为灵敏度过低，基质中本来存在的分析物却不被检出，导致想获取的分析物数据信息难以获得；另，对于ELISA法来讲，灵敏度过低，可能样品就不能稀释或必须稀释很小的倍数下被检测，必然耗费样品的体积量偏大，对于宝贵的临床资源来说，也是一种变相浪费。灵敏度高的检测方法，意味着样品可以更多倍数的稀释，更少的样本体积的消耗。高灵敏度的方法对于基于分析物的检测项目适用范围要广于低灵敏度的基于分析物的检测项目。因为即使低灵敏度的方法就可以测的含目标分析物浓度高的样品可以稀释后放在高灵敏度的方法中测，而分析物含量低的样品却不可以放在低灵敏度的方法中去测。这涉及到方法的普适性问题。
技术实现思路
为了有利于艾塞那肽相关产品在临床前及临床上血液等基质中被有效检测，更灵敏地捕捉其信号，为血药中相关药代动力学分析提供更好的支持手段，本专利技术在传统的ELISA法检测手段上进行了创新。基于抗原抗体反应的基础上，运用竞争性方式结合化学发光的手段，进行艾塞那肽的检测。本专利技术提供一种测定游离艾塞那肽的方法，其包括以下步骤：(1)将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；(2)在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；(3)在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；(4)在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；(5)在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；(6)将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。本专利技术基于抗原抗体反应的原理，与同类方法相比，创新性地基于抗原抗体反应的，及游离抗原与标记抗原，游离融合蛋白与标记蛋白的竞争性原理，结合化学发光信号放大的技术原理，开发了针对艾塞那肽的一种新的更灵敏的竞争性化学发光免疫检测方法。竞争的方法有利于半抗原基于抗原抗体反应的检测，让游离抗原优先进入反应体系的非平衡式的竞争更加有利于低浓度游离艾塞那肽与生物素标记的竞争，促进灵敏度，另化学发光信号比普通的光吸收信号对微小浓度差异的区分更加敏感，有利于促进灵敏度。较佳地，步骤(1)包括：使用碳酸盐缓冲液稀释抗艾塞那肽的抗体溶液到1μg/mL，以每孔100μL以下加入到多孔微孔板中，2～8℃孵育12～24小时，优选地，所述抗艾塞那肽的抗体为鼠抗艾塞那肽单抗；使用含0.05％吐温-20的PBS溶液洗板；加入含3％～5％脱脂牛奶的PBS溶液封闭，再使用含0.05％吐温-20的PBS溶液洗板。较佳地，步骤(2)中，所述不同浓度的艾塞那肽标准品包括浓度范围9000pg/mL～4.1pg/mL内的梯度稀释的5个以上艾塞那肽标准品，优选地，浓度梯度分别为9000pg/mL，3000pg/mL，1000pg/mL，333.3pg/mL，111.1pg/mL，37.0pg/mL，12.3pg/mL，4.1pg/mL。较佳地，步骤(2)中，所述艾塞那肽标准品和/或待测样品的基质为缓冲液、细胞培养液、血清中的任意一种。即，待测样品可为待测的细胞培养液中、组织提取液中或血清中的样品。血清中的样品可进行MRD(最小稀释倍数)为100倍的稀释，稀释用PBST稀释。步骤(2)中，孵育时间可为30～45分钟。较佳地，步骤(3)中，加入1:(45000～55000)倍用PBS稀释的生物素标记的艾塞那肽，37℃孵育1～2小时。本专利技术可采用非平衡式的竞争法，在加生物素标记的艾塞那肽之前，待测样品和标准品优先孵育30～45分钟，然后加入生物素孵育与样品、标准品一起同步继续孵育1～2小时。较佳地，步骤(4)中，加入1:(20000～25000)倍用PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育45分钟～1小时。较佳地，步骤(5)中，所述化学发光底物为SuperSignalTMELISAFemtoSubstrate。较佳地，步骤(5)中，反应1～2分钟后，在425nm的波长下读板以检测化学发光信号值。较佳地，步骤(6)中，以五参数方程拟合标准曲线。本专利技术中，待测样品可以含有游离的艾塞那肽和/或重组的艾塞那肽。本专利技术具有以下优点：1)提高灵敏度，拥有更低的定量下限；2)针对于艾塞那肽这样的短肽半抗原用更加敏感的检测方法；3)促进检测方法在血液样品检测中的普遍适用性；4)灵敏度提高，增加样品的稀释倍数，可以节约样本量；5)不仅适用于测定游离的艾塞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定游离艾塞那肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；（2）在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；（3）在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；（4）在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；（5）在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；（6）将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种测定游离艾塞那肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；（2）在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；（3）在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；（4）在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；（5）在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；（6）将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：使用碳酸盐缓冲液稀释抗艾塞那肽的抗体溶液到1µg/mL，以每孔100µL以下加入到多孔微孔板中，2～8℃孵育12～24小时，优选地，所述抗艾塞那肽的抗体为鼠抗艾塞那肽单抗；使用含0.05%吐温-20的PBS溶液洗板；加入含3%～5%脱脂牛奶的PBS缓冲液封闭，再使用含0.05%吐温-20的PBS溶液洗板。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述不同浓度的艾塞那肽标准品包括浓度范围9000pg/mL～4.1pg/mL内的梯度稀释的5个以上艾塞那肽标准品，优选地，浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：章登吉，任朋亮，常亚敏，
申请(专利权)人：上海美迪西生物医药股份有限公司，美迪西普亚医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31