一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5F7‑biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。可快速检测癌症及糖尿病病人血清中的PGRN蛋白含量，由多功能酶标仪进行定量分析，结果准确可靠，为临床检验和基础研究提供了一种新的辅助工具。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒
本专利技术涉及生物技术和医学检测研究领域的试剂盒，具体涉及一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。
技术介绍
双夹心ELISA检测方法操作简单、高效、可靠、适用于大批样品快速筛选，基于单克隆抗体的双夹心ELISA较多克隆抗体更稳定，特异性更强。颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)是一种含有593个氨基酸的分泌性糖蛋白，含有7.5个半胱氨酸结构域，命名为GrnP，GrnG，GrnF，GrnB，GrnA，GrnC,GrnD，GrnE。PGRN与胚胎发育，损伤修复，炎症，肿瘤的发生发展等生理病理过程息息相关。研究表明，人血清中PGRN的含量与一些疾病有关，如：糖尿病，肿瘤，神经退行性疾病等，PGRN作为一种分泌性糖蛋白，可以作为诊断这些相关疾病的标志物，对于这些疾病的诊断、治疗、监控及预后提供了重要的依据，所以快速、准确、高灵敏度地检测相关病人血清中的PGRN蛋白的含量尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种简便、灵敏度高、特异性强、适应大规模检测的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。为了实现上述任务，本专利技术通过以下技术方案得以实现：一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。根据本专利技术，所述包被抗体4F10是针对人PGRN中GrnA结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为10μg/mL。进一步地，所述生物素标记的检测抗体5B77-biotin是针对人PGRN中GrnB结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作稀释比例为1：4000。所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述底物液为TMB，即四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)底物缓冲液；所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液。所述人PGRN标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；所述Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法将纯化的Avidin与HRP蛋白交联。所述的过碘酸钠法是将HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；所述的Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。根据申请人的试验表明，本专利技术的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，可以用于乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学的检测应用。所述乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学的检测是检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白。检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白具体包括以下步骤：(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体4F10稀释成10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入5B7-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min。(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后,酶标仪450nm处读数。本专利技术的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒与现有技术相比，带来的有益技术效果在于：(1)所采用包被抗体和酶标抗体均为针对PGRN的单克隆抗体，较多克隆抗体更稳定，特异性更强；(2)可快速检测癌症及糖尿病病人血清中的PGRN蛋白含量，由多功能酶标仪进行定量分析，结果准确可靠，为临床检验和基础研究提供了一种新的辅助工具。附图说明图1是适用于检测人PGRN双夹心ELISA试剂盒的抗体最优配对筛选；图2是基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的优化；图3是基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒检测灵敏度的确定；图4是双夹心ELISA试剂盒检测不同人群血清中PGRN蛋白的结果，其中A图中，NGT为非糖尿病人群，T2D为Ⅱ型糖尿病病人，B图中，Breastcancergroup为乳腺癌人群，lungcancer为肺癌人群，Healthgroup为健康人对照。以下结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。具体实施方式本实施例给出一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。第一方面，采用单克隆抗体是运用杂交瘤细胞技术，通过人PGRN各个结构域Grns蛋白分别免疫小鼠，将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过细胞克隆化与间接ELISA方法获得的11株针对人PGRN各个结构域的小鼠抗人单克隆抗体：4G3，2E2，1G6，4E8，5B7，4F10，2A5，3C5，3F9，1D5，3F7；再对11株单克隆抗体进行生物素(Biotin)标记，将包被抗体与酶标抗体分别进行双夹心抗体配对，筛选出最佳单克隆抗体配对：4F10(针对GrnAdomain)和5B7(针对GrnBdomain)第二方面，本实施例给出的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。其中：(1)包被抗体4F10的最优的抗体工作浓度为10μg/mL；(2)人PGRN标准蛋白，通过真核蛋白纯化的方法获得；(3)生物素标记的检测抗体5B7-biotin，通过生物素标记试剂盒(Thermo公司售)获得，工作最佳稀释比例：1：4000。(4)Avidin与HRP的交联蛋白，通过过碘酸钠法是HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。(5)包被缓冲液，0.05M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)；(6)封闭液，含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)；(7)样品及检测抗体稀释液，含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)；(8)ELISA酶标板洗涤液，含体积分数为0.1％Tween-20的PBS(PBST，pH7.4)；(9)底物液，含TMB的底物缓冲液；第三方面，本实施例给出的基于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7‑biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。

【技术特征摘要】
1.一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。2.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗体4F10是针对人PGRN中GrnA结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为10μg/mL。3.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的检测抗体5B7-biotin是针对人PGRN中GrnB结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作稀释比例为1：4000。4.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；所述底物液为TMB；所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液。5.如权利要求1所述的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述人PGRN标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；所述Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法将纯化的Avidin与HRP蛋白交联。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，李彦青，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61