本发明专利技术公开了一种Fe2+-H2O2-亚甲基蓝化学发光体系测定绿原酸的方法。用H2SO4作为溶剂，配制硫酸亚铁铵溶液；用二次蒸馏水作为溶剂，配亚甲基蓝溶液、双氧水、绿原酸标准溶液和样品绿原酸溶液。主动泵分别将制备好的硫酸亚铁铵溶液和绿原酸标准溶液进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪；副动泵将制备好的亚甲基蓝溶液和双氧水注入流通池，检测其化学发光强度I，记录数据；做出标准曲线方程：I＝-4.0125x+2047，其中x以μg/ml计，浓度在1～500μg/ml范围，R2＝0.9944。按照上述操作过程，测试样品绿原酸的化学发光强度，代入标准曲线方程，计算样品绿原酸的含量：x＝(2047-I)/4.0125，其中x以μg/ml计。本发明专利技术检测方法简单、成本低，可在线进行常规性测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及绿原酸的测定方法，具体是用Fe2+-H2O2-亚甲基蓝化学发光体系测定绿原酸的方法。本专利技术属于植物化学、天然产物化学、食品化学、分析化学、有机化学、生物化学、植物次生代谢物质的生理学、植物生物活性物质、食品、保健品、药品等研究领域。
技术介绍
绿原酸(Chlorogenic acid)又叫咖啡鞋酸,化学名为3_咖啡酰奎尼酸。绿原酸是一种多酹类化合物，由一分子咖啡酸(Caffeic acid)和一分子奎尼酸(Quinic acid, I-轻基六氢没食子酸)缩合脱水而成的缩酚酸，分子结构见说明书附图，它是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸具有较强的药理活性，具有广谱抗菌，抗病毒及抗真菌的作用，主要用于清热解毒、凉散风热，痛肿疗疮，喉痹丹毒，热血毒痢，风热感冒等疾病的治疗，能降低血液中胆固醇含量，加强机体防御机能，具有较高的药用价值。随着抗生素滥用及不良反应的增加，开发具有良好抗菌效果的中药的呼声越来越高。绿原酸作为抗菌作用显著的中药，越来越受到医药界关注。因此，对绿原酸含量的检测也成为必不可少的重要组成部分。目前国内外定性和定量分析绿原酸的方法主要有分光光度法(袁华，邓良，孙炎彬2007)、高效液相色谱法(梅林2007 ;朱晴峰，陈梅荣等2011)、薄层色谱法(聂松柳，孟楣2010)、毛细管电泳法(杨新等1999 ;吕元琦，部春华，袁倬斌2004)和化学发光法(贺彩霞，陆明刚1997 ;张红影，徐向东，石红梅等2011)。现有检测方法存在一定的缺陷分光光度法比较耗时，且重现性差；高效液相色谱法仪器比较贵，同时需要专业技术人员，培养一名优秀的检测师需要很长的时间，另外专用色谱纯的流动相和色谱柱比较贵；薄层色谱法和毛细管电泳法所用的化学试剂比较多， 步骤繁琐，适合于小样品的纯化；张红影，徐向东等做的化学发光法需要用到比较贵重的 Ag(III);贺彩霞，陆明刚等做的化学发光法干扰物质较多不便广泛应用。化学发光分析法由于其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单，越来越受到人们的青睐。采用鲁米诺-铁氰化钾发光体系和鲁米诺-KIO4体系测定绿原酸的方法文献有报道，但Fe2+-H2O2-亚甲基蓝化学发光体系用于绿原酸的测定未见报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有检测方法的缺陷，提供一种操作更加简单，检测成本低， 标准曲线的线性好的Fe2+-H2O2-亚甲基蓝化学发光体系测定绿原酸的方法。具体步骤为(I)制备试剂用I 20X l(T3mol/L H2SO4作为溶剂，配制I 20X l(T3mol/L的硫酸亚铁铵溶液(Fe2+);用二次蒸馏水作为溶剂，分别配制I 20X10_5mol/L的亚甲基蓝溶液、体积百分比浓度为O. I 5%的双氧水、浓度为O. 001 10mg/mL的绿原酸标准溶液和样品绿原酸溶液。(2)流动注射化学发光检测仪的设定主动泵分别将步骤(I)制备好的硫酸亚铁铵溶液(Fe2+)和绿原酸标准溶液以30 60r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪；副动泵将步骤(I)制备好的亚甲基蓝溶液和双氧水以50 80r/min的流速通过十六通注射阀注入流通池，注样时间10 20秒，各液混合，检测其化学发光强度I，记录数据。上述测试过程在35°C 土1°C恒温进行；(3)做出标准曲线方程I =-4. 0125X+2047,其中X以yg/ml计，浓度在I 500 μ g/ml 范围，R2 = O. 9944 ；(4)样品绿原酸含量测定按照步骤(2)操作过程，测试样品绿原酸的化学发光强度，代入标准曲线方程，计算样品绿原酸的含量x= (2047-1)/4. 0125，其中X以μ g/mlif ο在优化的条件下，绿原酸标准溶液的浓度在I 500 μ g/nf范围内与发光强度I呈线性关系I = -4. 0125X+2047，其中x以μ g/ml if, R2 = O. 9944，这表明可利用这一方法对绿原酸进行定量分析。本专利技术与现有的方法相比，本测定方法的仪器设备简单，操作方便，分析快速，检测成本低，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，可在线进行常规性测定，易于应用到工业或农业生产中。本专利技术是一种在线检测绿原酸的方法。一般以往检测一个绿原酸样品需要20 30分钟，本专利技术所需时间仅仅在5分钟之内，比现有的其它检测方法迅速，因此可以应用于绿原酸的提取和纯化及结晶的工业化生产；富含绿原酸植物的栽培和育种；绿原酸在食品、保健品、药品中的含量检测。附图说明附图为绿原酸的分子结构图。具体实施例方式实施例I.仪器设备IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子有限公司)。整个分析过程中采样、注样、实验数据采集及处理，均由Windows XP系统下IFFM-E型流动注射化学发光分析仪完成。2.材料与试剂2. I 材料绿原酸标准品中国药品生物制品检定所；绿原酸样品西安奥泽生物科技有限公司。2. 2制备试剂用O. 01mol/L H2SO4作为溶剂，配制2. 2X 10_3mol/L的硫酸亚铁铵溶液(Fe2+);用二次蒸馏水作为溶剂，配制6. 4X10_5mol/L的亚甲基蓝溶液、体积百分比浓度O. 5%双氧水、浓度为10mg/mL绿原酸标准溶液和样品绿原酸溶液；再用浓度为10mg/mL 绿原酸标准溶液制备出浓度区间I 1000 μ g/mL的多个不同浓度的系列溶液，以备制做标准曲线时使用。3.流动注射化学发光检测仪的设定主动泵分别将制备好的硫酸亚铁铵溶液 (Fe2+)和绿原酸标准溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪；副动泵将制备好的亚甲基蓝溶液和双氧水以55r/min的流速通过十六通注射阀注入流通池，注样时间15秒，各液混合，检测其化学发光强度，记录数据，做出标准曲线方程(I = _4.0125x+2047);然后重复上述操作过程，测试样品绿原酸的化学发光强度 (I = 1653. O)，代入标准曲线方程，计算样品绿原酸的含量(X = 98. 2 μ g/ml)。上述测试过程在35 °C ±1°C恒温进行。4.试验与结果分析4. I试验条件的优化4. I. I流路参数的选择流速的影响在流动注射分析中，流速是影响测定灵敏度的一个重要因素。流速太慢会导致最大发光在流通池之前，流速太快会导致最大发光在流通池之后，在固定最短阀池距的前提下，对主副蠕动泵的转数在10 90r/min范围内进行考察，确定最佳主副泵的转数分别为 45r/min(2. 25ml/min)和 55r/min(2. 75ml/min)时，I 最大。其它参数流通管(聚四氟乙烯管)内径为O. 8mm,阀池距为12cm，光电倍增管负高压为800V。4. I. 2单因素试验确定反应介质的浓度范围 Fe2+浓度试验考察了 Fe2+浓度在I. OX 10_4 ~ 5. OX 10_3mol/L范围内对化学发光强度的影响，结果表明化学发光强度随Fe2+浓度增加而增大，当Fe2+浓度超过 2. 2X10_3mol/L时发光强度趋于稳定。根据考察结果筛选出Fe2+浓度为2. 2X10_3mol/L。亚甲基蓝浓度试验考察了亚甲基蓝浓度在1.0X10_5 1.0X10本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝再彬，蒋泽军，吴琼，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：
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