梅花鹿鉴定引物及方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种梅花鹿鉴定引物及方法和应用，属于物种鉴定技术领域。该鉴定引物包括：内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。该引物能够特异性的快速扩增梅花鹿核酸，解决鹿茸在“真伪”鉴别上的瓶颈性难题。

Identification primers, methods and applications of Sika Deer

The invention relates to a primer identification method and application, belonging to the technical field of species identification. The primers included: internal primer FIP:TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT, internal primer BIP:TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG, external primer F3:TCTATGTCCTACTAATTACAC, external primer B3:GACTGATTTGACTTAATGCAC, ring primer LF:ACACGTGTGTCTTAATGTAC, and ring primer LB:TCCTATCATTTATAGTACATAGT. . The primer can specifically amplify the nucleic acid of sika deer, and solve the bottleneck problem of velvet antler identification.

【技术实现步骤摘要】
梅花鹿鉴定引物及方法和应用
本专利技术涉及物种鉴定
，特别是涉及一种梅花鹿鉴定引物及方法和应用。
技术介绍
鹿茸是指梅花鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，是名贵药材。鹿茸中含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白质及钙、磷、镁、钠等成分，其中氨基酸成分占总成分的一半以上。李时珍在《本草纲目》上称鹿茸“善于补肾壮阳、生精益血、补髓健骨”，为一种传统的名贵中药。但是，目前市场上大量的鹿茸制品真伪不用，存在鉴别上的难题，亟需一种快捷、理想、可靠的标准化、规范化的鉴别方法。2000年，Notomi等专利技术了环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA，LAMP)，可以在等温条件下实现核酸扩增。LAMP技术的反应原理是，根据序列保守区域设计的一对外引物，一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～67℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，检测时间大大缩短，而且快速敏感。目前，LAMP技术在细菌和病毒检测、耐药基因检测、寄生虫检测、胎儿性别鉴定等方面被广泛应用。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种梅花鹿鉴定引物及方法，采用该引物及方法，能够快速检梅花鹿核酸，为鹿茸等动物类药材的标准化鉴定提供新的思路，解决鹿茸在“真伪”鉴别上的瓶颈性难题。一种梅花鹿鉴定引物，包括以下引物：内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。上述引物，是专利技术人根据梅花鹿基因组的特点，经过反复实验后得到，其中，核心区域F1(FIP后段)和LF被放置到梅花鹿特异插入片段，保证了该套引物的特异性。该套引物用于扩增非梅花鹿核酸时，由于缺失了该片段，扩增时，导致FIP引物不能形成环状哑铃状结构，因此无法进行LAMP指数扩增，从而不能扩增非梅花鹿核酸。此外，环引物LF也位于特异性的插入片段，仅仅只有当扩增梅花鹿核酸时才能进行加速扩增，进一步保证了特异性。在其中一个实施例中，所述内引物FIP和BIP的工作浓度为35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作浓度为8-12pmol，所述环引物LF和LB的工作浓度为16-24pmol。采用上述浓度配比，具有较好的扩增效率。本专利技术还公开了一种梅花鹿鉴定方法，包括以下步骤：环介导恒温核酸扩增：采用上述的引物对待测样品的基因组进行扩增；判定：通过测定反应液的浊度，浊度上升为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，浊度无变化为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品；和/或往反应液中加入钙黄绿素指示剂，反应液为绿色为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，反应液橙色为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品。以上述方法对梅花鹿品种进行鉴定，具有特异性高、快捷和可靠的优点。在其中一个实施例中，所述环介导恒温核酸扩增步骤中，扩增反应体系为25μl，包括如下组分：待测物的基因组DNA2μl，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase；引物加入量为：40pmol内引物FIP和内引物BIP，20pmol序列表中环引物LF和环引物LB，5pmol序列表中外引物F3和外引物B3。采用上述扩增体系，具有较好的扩增效果。在其中一个实施例中，所述环介导恒温核酸扩增步骤中，扩增反应的温度为60-62℃，扩增反应的时间为60-70min。采用上述温度和时间，具有较好的扩增效果。在其中一个实施例中，所述判定步骤中钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。本专利技术还公开了上述的梅花鹿鉴定引物在鉴定梅花鹿品种中的应用。本专利技术还公开了一种梅花鹿鉴定试剂盒，包括上述的引物。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括DNA提取试剂、环介导恒温核酸扩增试剂、显色指示剂和缓冲溶液中的至少一种。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的一种梅花鹿鉴定引物，能够准确、快速和特异性的对梅花鹿品种进行鉴定，为鹿茸等动物类药材的标准化鉴定提供新的思路，解决鹿茸在“真伪”鉴别上的瓶颈性难题，为鹿茸建立一种更加快捷、理想、可靠的标准化、规范化的鉴别方法。附图说明图1为实施例1中样本检测浊度-时间变化曲线图；其中：横坐标为时间，纵坐标为浊度值；图2为实施例1中样本检测终浊度图；图3为实施例2中不同稀释度样品浊度图；图4为实施例3中不同温度扩增样品浊度图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除另有说明外，以下实施例中所用试剂均为市售。实施例1LAMP法快速检测梅花鹿核酸方法建立1实验方案1.1材料市售购得12份鹿茸样本(0740，0741，0742，0743，0744，0745，0746，0747，0748，0749，0750，0751)，其中，0748为马鹿样本，0749为驯鹿样本，并加入了猪，鸭，鸡，牛血清样本做为待测样本。1.2仪器与试剂LAMP法核糖核酸扩增试剂盒(DNAAmplificationKit)，日本荣研化学株式会社(EIKENCHEMICALCO.,LTD,Tochigi,Japan)；LAMP反应管(ReactionTube)，日本荣研化学株式会社；可视染料(Te)，北京海泰正元生物科技有限公司。实时浊度仪La-320C，日本荣研化学株式会社。1.3方法1.3.1Targettemplate目标模板的制备按照常规方法分别提取12份鹿茸和猪，鸭，鸡，牛血清中的核酸，即得目标模板。1.3.2LAMP反应引物的设计专利技术人根据梅花鹿基因组的特点，经过反复对比筛选后发现，在序列HQ832482.1(梅花鹿)中存在一段插入序列(共74bp，以下标记为斜体带下划线)，如下表所示，该片段不存在于AB245426.1和AB245427.2(即马鹿和驯鹿)中。因此围绕该片段和该片段前后的序列设计LAMP引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梅花鹿鉴定引物，其特征在于，包括以下引物：内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。

【技术特征摘要】
1.一种梅花鹿鉴定引物，其特征在于，包括以下引物：内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。2.根据权利要求1所述的梅花鹿鉴定引物，其特征在于，所述内引物FIP和BIP的工作浓度为35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作浓度为8-12pmol，所述环引物LF和LB的工作浓度为16-24pmol。3.一种梅花鹿鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：环介导恒温核酸扩增：采用权利要求1-2任一项所述的引物对待测样品的基因组进行扩增；判定：通过测定反应液的浊度，浊度上升为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，浊度无变化为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品；和/或往反应液中加入钙黄绿素指示剂，反应液为绿色为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，反应液橙色为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏畅，王淑红，关潇滢，王洋，刁璇，王铁杰，鲁艺，
申请(专利权)人：深圳市药品检验研究院深圳市医疗器械检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44