一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法技术

本发明专利技术提供的一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法，涉及酶制剂技术领域。一种发酵培养基，按重量百分比计，包括：碳源3～6％，无机盐2.5～4.5％，PTM10.4～1.2％，余量的水。该培养基减少发酵不稳定因素，降低成本，高效发酵。一种高效表达蛋白的发酵方法，包括：将菌体接种至装有第一培养基的摇瓶中进行培养，使菌液的光密度值不小于10。将菌液接种至含有上述发酵培养基的第一培养罐中进行发酵。该方法操作简便，可控性强，适合大规模生产。

Fermentation method for fermentation medium and high expression protein

The invention provides a fermentation medium and a fermentation method for efficiently expressing protein, and relates to the technical field of enzyme preparation. A fermentation medium based on weight percentage, including carbon source 3 to 6%, inorganic salt 2.5 ~ 4.5%, PTM10.4 ~ 1.2%, surplus water. The medium can reduce the factors of fermentation instability, reduce the cost, and efficiently ferment. A fermenting method for highly efficient protein expression includes: inoculating the bacteria into a shake flask with the first medium, making the light density of the bacteria less than 10. The bacteria were inoculated into the first culture tank containing the above fermentation medium for fermentation. The method is simple, controllable and suitable for mass production.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法
本专利技术涉及酶制剂
，且特别涉及一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法。
技术介绍
毕赤酵母(Pichiapastoris)目前已是仅次于大肠杆菌的最常用外源蛋白表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。在酶制剂领域中，植酸酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等生物酶制剂利用毕赤酵母已实现了产业化规模的生产。目前工业中生产的酶制剂基本上都是采用微生物液态发酵法。液态发酵制备酶制剂通常分为两个阶段：一是菌体生长阶段，二是外源蛋白表达阶段。在菌体生长阶段，其目标是实现高细胞密度，也就是通常所说的增加湿重，由于培养基浓度过高往往会产生反馈抑制的作用，表现为抑制菌体生长，因此前期培养过程营养物质浓度不宜过高。外源蛋白表达阶段，即微生物产酶阶段。现有方法在菌体生长阶段加入的培养基无机盐成分多、浓度高，这不仅会影响菌体生长，也会增加发酵的生产成本，而且，不同厂家的无机盐在质量上存在差异，其结果导致发酵不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种发酵培养基，该培养基减少发酵不稳定因素，降低成本，高效发酵。本专利技术的另一目的在于提供一种高效表达蛋白的发酵方法，该方法操作简便，可控性强，适合大规模生产。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种发酵培养基，按重量百分比计，包括：碳源3～6％，无机盐2.5～4.5％，PTM10.4～1.2％，余量的水。一种高效表达蛋白的发酵方法，包括：将菌体接种至装有第一培养基的摇瓶中进行培养，使菌液的光密度值不小于10。将菌液接种至含有上述发酵培养基的第一培养罐中进行发酵。本专利技术实施例的一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法的有益效果是：本专利技术采用的发酵培养基在不影响发酵整体水平的同时，减少培养基中无机盐的种类及浓度，减少了无机盐种类多导致的发酵不稳定因素，也能克服制备成本高的不足。实现了低成本、高效发酵，所制备的酶活均能保持原有高水平。进一步地，在发酵过程中采用分阶段发酵培养，使得菌种逐渐适应发酵环境，在每一阶段均得到充分的营养，并且进行充分的生长，使得生长的酶具有较好的酶活性。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种发酵培养基及高效表达蛋白的发酵方法进行具体说明。本专利技术实施例提供的一种发酵培养基，按重量百分比计，包括：碳源3～6％，无机盐2.5～4.5％，PTM10.4～1.2％，余量的水。碳源作为微生物生长的营养物质，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。在本专利技术中，碳源包括葡萄糖、甘油、山梨醇以及糖浆中的至少一种。无机盐为微生物提供生长所需的物质。进一步地，在本专利技术较优的实施例中，按重量百分比计，无机盐包括磷酸二氢钾1～2％，硫酸镁1～2％，硫酸铵0.5～1.5％。镁起到酶激活剂的作用，磷是蛋白质、核酸的组成部分，磷是细胞膜的组成部分，在培养基中还可以起到缓冲作用。PTM1是一种微量元素盐，为微生物的生长提供营养物质。本专利技术中的PTM1为本
的常用物质，本专利技术对其不做限定。现有的培养基中无机盐成分多、浓度高，成本较高。由于无机盐在购买时不同厂家的质量不同，导致发酵不稳定，影响菌体的生长。该发酵培养基中的无机盐含量少、种类少，降低了成本的同时，可以保持原有的高水平发酵，具有较好的应用前景。本专利技术提供了一种高效表达蛋白的发酵方法，包括：选用重组毕赤酵母作为菌体。较优的，重组毕赤酵母的基因型为Mut+。1.摇瓶培养用接种环将第一培养基斜面上的菌体取一环到装有液体第一培养基的摇瓶中，在29～30℃、搅拌速率为210～220rpm的条件下，摇床培养21～22小时，使菌液的OD值≧10。在本专利技术的实施例中，第一培养基为YPD培养基。在本专利技术的其他实施例中，第一培养基也可以为MS培养基等。YPD培养基包括：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g。液体YPD培养基的制备为：将葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g与1000mL的水混合。在110～120℃的条件下灭菌10～30min。采用摇瓶培养使得重组毕赤酵母活化，以适应生长环境。2.发酵培养将摇瓶中的菌液接种至第一培养罐中进行发酵培养。第一培养罐中的培养基为本专利技术提供的发酵培养基，无机盐含量少。进一步地，在本专利技术较优的实施例中，发酵培养基的pH值为5.2～5.6，发酵培养基在120～122℃的条件下灭菌25～35min。菌液接种至第一培养罐中后，在风量为30～40m3/h、温度为29～30℃、初始发酵pH值为4.7～4.9、转速为140～160rpm的条件下发酵培养22～26h。菌液在第一培养罐中正常的发酵，可以制备得到具有较好酶活性的酶。为了进一步的提高菌种的发酵和酶的活性，本专利技术采用分阶段发酵。菌液在第一培养罐中发酵22～26h后，将第一培养罐中的第一种子液接种至含有发酵培养基的第二培养罐中，第一种子液接种至第二培养罐后，在风量为340～360m3/h、温度为29～30℃、初始发酵pH值为4.7～4.9、转速为170～180rpm的条件下发酵培养。第一种子液接种至第二培养罐发酵培养9～12h后，将第二培养罐中的第二种子液接种至第三培养罐中，在风量为1800～2100m3/h、温度为29～30℃、初始发酵pH值为4.7～4.9、转速为120～140rpm的条件下发酵培养。在利用本专利技术的提供的无机盐含量少的发酵培养基的情况下，分阶段发酵培养使得菌种逐渐适应发酵环境，在每一阶段均得到充分的营养，并且进行充分的生长，使得生长的酶具有较好的酶活性。在发酵的过程中，随着发酵的进行，发酵液的pH值会降低，影响发酵速率以及发酵质量。本专利技术采用氨水调节发酵液的pH值，同时氨水也作为培养基中的氮源成分，为菌种提供营养。当发酵液的pH值回升、发酵液的湿重大于100g/L时，进入补料阶段。向发酵罐中流加浓度为30％的葡萄糖。当发酵液湿重大于260g/L时，停止补料。补料是为了避免一次性加入所有的营养物质，使得培养过程中营养物质浓度过高导致产生反馈抑制作用，抑制菌体的生长。补料则逐渐加入营养物质，使得菌体充分的生长。补料结束1～2h后，进行诱导阶段，即微生物产酶阶段。前六个小时内，流加甲醇，六个小时后，根据发酵情况逐渐增加流加的甲醇量。当酶活性达到标准后停止发酵，在本专利技术中，当酶活日增长小于5％时，即停止发酵。以下结合实施例对本，专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种高效表达蛋白的发酵方法，包括：选用重组酵母菌株(HBZ-III，保藏在绵阳禾本生物工程有限公司)作为菌体。用接种环将YPD培养基斜面上的菌体取一环到装有200mL液体第一培养基的500mL摇瓶中，接种5个摇瓶。在29.5℃、搅拌速率为210rpm的条件下，摇床培养21小时，使菌液的OD值≧10。将5个摇瓶中的菌液接种至500L的第一培养罐中进行发酵培养。第一培养罐中的培养基包括：葡萄糖5％，磷酸二氢钾1.5％，硫酸镁1.5％，硫酸铵0.8％，PTM10.5％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵培养基，其特征在于，按重量百分比计，包括：碳源3～6％，无机盐2.5～4.5％，PTM10.4～1.2％，余量的水。

【技术特征摘要】
1.一种发酵培养基，其特征在于，按重量百分比计，包括：碳源3～6％，无机盐2.5～4.5％，PTM10.4～1.2％，余量的水。2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，按重量百分比计，所述无机盐包括磷酸二氢钾1～2％，硫酸镁1～2％，硫酸铵0.5～1.5％。3.一种高效表达蛋白的发酵方法，其特征在于，包括：将菌体接种至装有第一培养基的摇瓶中进行培养，使菌液的光密度值不小于10；将所述菌液接种至含有如权利要求1或2所述的发酵培养基的第一培养罐中进行发酵。4.根据权利要求3所述的高效表达蛋白的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为5.2～5.6，所述发酵培养基在120～122℃的条件下灭菌25～35min。5.根据权利要求3所述的高效表达蛋白的发酵方法，其特征在于，将所述菌液接种到所述第一培养罐后，在风量为30～40m3/h、温度为29～30℃、初始发酵pH值为4.7～4.9、转速为140～160rpm的条件下发酵培养。6.根据权利要求5所述的高效表达蛋白的发酵方法，其特征在于，所述菌液接种到所述第一培养罐发酵培养22～26h后，将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟勇，鲁进，尤雅，高怀春，钱美会，杨滔，
申请(专利权)人：绵阳禾本生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51