通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法技术

提供用于原位扩增(ISA)样品中的cfNA、诸如cfDNA的方法，其中样品中的cfNA不经受核酸纯化步骤。所公开的方法可用于产生样品中存在的cfNA的可分析汇集物。可分析汇集物可与多种分析技术一起使用以表征样品中的核酸。还提供了受试者的诊断、确定治疗性干预和监测的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年8月12日提交(目前未决)的美国临时专利申请第62/204,268号的优先权。
技术介绍
据估计，今年诊断出160万的癌症新病例，导致超过50万的癌症死亡。这意味着每天约1,600人，占美国死亡人口的四分之一。实体瘤活检的遗传测试的主要进展改变了癌症的靶向和治疗方式，从而导致存活率提高。目前，通常来自原发性肿瘤的组织活检用于在靶向疗法开始之前的某单个时间点确定癌症的分子谱。然而，实体瘤取样有几个缺点和局限性。首先，实体瘤取样是一种侵入性手术，并且在很多情况下会给患者带来风险。其次，在某些情况下，由于肿瘤的位置和/或大小，实体瘤取样不是一种选择，或者是不切实际的。第三，由于实体瘤取样在空间上局限于活检区域并且在时间上局限于活检时的肿瘤状态，因此可能无法充分解决肿瘤异质性。肿瘤基因组非常不稳定，并且在选择压力下容易发生克隆扩增。因此，癌症的基因组标签在空间上和时间上都变化，并且本质上不是静态的。第四，鉴别来自实体瘤取样的相关信息用于进行治疗决策可能需要几天到几周或甚至几个月，这使信息在治疗应用中的使用变得复杂。第五，实体瘤取样的费用很高，因此在很多情况下限制了它的应用。最后，实体瘤取样对于癌症疗法的纵向监测由于诸多因素(诸如分析所需的时间、分析成本和获得分析样品的侵入性等)是不切实际的。因此，肿瘤组织的基因组表征仍然是癌症治疗和管理中的主要挑战。特别是循环细胞游离DNA(cfDNA)的血液活检(也被称为液体活检)正在成为用于鉴别肿瘤中存在的特定遗传改变的非侵入性方法。目前正在研究此类方法，以鉴定可由已知的癌症疗法治疗的那些突变，并为治疗开发靶向疗法。用于分离、定量和分析血液中cfDNA的先进技术已经导致鉴别循环中的癌症-特异性畸变，诸如染色体异常、基因突变、甲基化模式的差异和拷贝数变化。这些畸变被发现反映来自实体瘤组织的那些畸变。利用cfDNA分析的血液活检为实体瘤取样遇到的缺点提供了解决方案。血液活检是微创的，允许在常规诊所就诊期间常规采集样品进行分析。此外，血液活检允许对多种肿瘤DNA取样，并克服实体瘤取样中所见的异质性缺乏。血液活检还提供诊断性信息快速返回给医疗保健提供者。最后，血液活检由于其微创性性质和快速结果，对于以最具成本效益的方式实时纵向监测肿瘤基因组进化是理想的。基于循环cfDNA的测试使临床医生具有实时确保治疗功效、监测耐药性、转移和复发及并为患者定制个体化治疗性干预措施的能力。使用循环cfDNA的肿瘤基因组测序来指导治疗决策将极大地改善临床结果。因此，cfDNA在癌症诊断和疗法的个体化管理中的临床实用性能够显著改变目前的治疗模型、提高总癌症存活率并成为新一代癌症管理的护理标准。然而，cfDNA的分析也存在几个缺点。此类限制包括但不限于需要样品体积大、cfDNA产率低、不同大小的cfDNA片段的不同回收率以及缺乏再现性。以上是在临床中基于cfDNA的测试的常规应用的主要障碍。目前，尽管采用了许多提取和分离cfDNA的方法，但由于从样品不完全提取cfDNA起始材料和此过程中的大量材料损失，cfDNA分离的效率和产率非常低。此外，由于缺乏标准化，定量是易变的。cfDNA的分析和使用cfDNA作为临床工具并不是最佳的。本公开通过提供用于从样品进行优异cfDNA富集的方法，提供了一种针对cfDNA分析中遇到的问题的新颖且有创造性的解决方案。此类方法需要低输入体积的样品，并且提供高的核酸材料回收率以用于随后的分析。因此，本公开的方法允许直接从样品中富集cfDNA。所公开的方法能够在范围广泛的基因组平台上使用微升体积(血滴体积)的样品进行多重分析，包括但不限于下一代测序(NGS)和qPCR。本公开的方法使临床医生能够使用小至10微升的样品体积(例如经由扎手指)工作。本公开的方法具有许多优势，包括但不限于涉及的遗传改变的更完整表征、加速的临床决策制定、靶向疗法的鉴定以及以既省时又省钱的方式鉴定符合条件的患者的实验性临床试验。因此，通过利用本公开的方法可以充分实现cfDNA分析的潜力。附图说明图1A显示了使用CGD方法从20μL血浆产生的cfDNA的琼脂糖凝胶电泳。使用溴化乙锭可视化cfDNA。泳道1-4是来自诊断为或疑似患有癌症的受试者的冷冻的临床血浆样品，泳道5是用来自样品4的血浆加标的来自健康受试者的新鲜血浆。泳道6-8是来自健康受试者的冷冻的血浆样品且泳道9-10是来自健康受试者的新鲜血浆样品。图1B显示了使用CGD方法从10μL尿产生的cfDNA的琼脂糖凝胶电泳。使用溴化乙锭可视化cfDNA。泳道1-6是来自健康受试者的新鲜尿样品且泳道7是用于比较的血浆样品。图2显示了对分别使用CGD方法和QIAamp试剂盒从20μL和200μL血浆制备的cfDNA使用TaqMan实时定量PCR产生的KRAS的扩增曲线图。图3A显示了对cfDNA使用TaqMan实时定量PCR产生的BRAF的扩增曲线图，所述cfDNA分别使用CGD方法和QIAamp试剂盒从20μL和200μL血浆制备。图3B显示了对cfDNA使用TaqMan实时定量PCR产生的PIK3CA的扩增曲线图，所述cfDNA分别使用CGD方法和QIAamp试剂盒从20μL和200μL血浆制备。图3C显示了对cfDNA使用TaqMan实时定量PCR产生的NRAS的扩增曲线图，所述cfDNA分别使用CGD方法和QIAamp试剂盒从20μL和200μL血浆制备。图4显示了使用CGD方法从使用商业唾液取样试剂盒(具有或不具有防腐剂)收集的20μL唾液产生的cfDNA的琼脂糖凝胶电泳(2％)。使用溴化乙锭可视化cfDNA。泳道1和泳道2显示了来自用具有防腐剂的商业取样试剂盒获得的唾液样品的结果，其中泳道3是阴性对照(无唾液样品存在)，而泳道4和泳道5显示了来自用不具有防腐剂的商业取样试剂盒获得的唾液样品的结果，其中泳道6是阴性对照(无唾液样品存在)。图5显示了使用CGD方法从20μL血浆和脑脊液及10μL尿产生的cfDNA的琼脂糖凝胶电泳(2％)。使用溴化乙锭可视化cfDNA。样品分配如下(其中cfDNA浓度在括号中)：泳道1CSF(8.5)，泳道2尿(5.1)，泳道3血浆(22)，泳道4血浆(59)，泳道5血浆(36.4)，泳道6阴性对照；泳道7尿(52.2)，泳道8尿(11.2)，泳道9尿(89.6)和泳道10尿(30)。图6显示了使用Agilent2100Bioanalyzer进行的图5的样品1至5的分析以确定由CGD方法从血浆、CSF和尿样品制备的cfDNA的尺寸分布和定量。图7显示了用CGD方法和组织活检获得的卵巢癌患者处理前和处理后的就PIK3CA、PTEN和KRAS基因而言的结果之间的比较。图8A显示了诊断为肺癌的受试者中的cfDNA突变的测定。疗法期间循环cfDNA中较低的突变负荷和稳定疾病50天之后升高的突变负荷。治疗起始由黑色箭头指示。突变负荷表达为每患者检测到的体突变的数目(图右侧上的垂直刻度)。蓝色虚线指示进行PET/CT的时间。时间点指示进行cfDNA分析的时间。图8B显示了受试者的PET/CT成像，指示2015年11月30日的稳定疾病和2016年本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原位扩增细胞游离核酸(cfNA)的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供含有多个cfNA的液体样品；b.对所述样品进行至少一个处理步骤；c.使用酶混合物添加外源性核酸序列至所述样品中的至少一部分的所述cfNA的5’末端或3’末端中的至少一者上，将所述样品中的至少一部分的所述cfNA转化为经修饰的cfNA以产生可扩增cfNA汇集物，其中所述外源性核酸序列含有能够结合引物的引物位点；和d.扩增所述可扩增cfNA汇集物以产生cfNA的可分析汇集物，其中所述样品中的所述cfNA不经受核酸纯化步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.12 US 62/204,2681.一种原位扩增细胞游离核酸(cfNA)的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供含有多个cfNA的液体样品；b.对所述样品进行至少一个处理步骤；c.使用酶混合物添加外源性核酸序列至所述样品中的至少一部分的所述cfNA的5’末端或3’末端中的至少一者上，将所述样品中的至少一部分的所述cfNA转化为经修饰的cfNA以产生可扩增cfNA汇集物，其中所述外源性核酸序列含有能够结合引物的引物位点；和d.扩增所述可扩增cfNA汇集物以产生cfNA的可分析汇集物，其中所述样品中的所述cfNA不经受核酸纯化步骤。2.如权利要求1所述的方法，其中所述cfNA是cfDNA。3.如权利要求1所述的方法，其中所述cfNA是cfRNA。4.如权利要求3所述的方法，其中在步骤(c)之前使所述cfRNA转化为双链DNA。5.如权利要求4所述的方法，其中所述酶混合物包含DNA酶活性。6.如权利要求1所述的方法，其中将所述样品中的至少一部分的所述cfNA连接在一起。7.如权利要求1所述的方法，其中所述样品中的所述cfNA具有以下的片段尺寸分布：50bp至2000bp、100bp至1000bp、50bp至600bp、100bp至500bp、100bp至400bp、100bp至300bp、100bp至200bp、200bp至300bp、300bp至400bp、400bp至500bp、或500bp至600bp。8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在单个反应容器中进行。9.如权利要求1所述的方法，其中所述引物位点是通用引物位点。10.如权利要求1所述的方法，其中将所述外源性核酸序列添加至所述cfNA的5’末端、所述cfNA的3’末端、或至少一部分的所述cfNA的5’末端和3’末端两者。11.如权利要求1所述的方法，其中所述样品中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的所述cfNA经修饰以含有所述外源性核酸序列。12.如权利要求1所述的方法，其中所述酶混合物包含：a.具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、和DNA连接酶；b.具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、DNA连接酶、和DNA多核苷酸激酶；c.具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA多核苷酸激酶、和尿嘧啶DNA糖基化酶；或d.具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA多核苷酸激酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、和单链DNA核酸切口酶。13.如权利要求1所述的方法，其中所述酶混合物包含：a.T4DNA聚合酶、和T4DNA连接酶；b.DNA聚合酶I的克列诺片段、和T4DNA连接酶；c.T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、和DNA聚合酶I的克列诺片段；d.T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I的克列诺片段、和T4多核苷酸激酶；e.T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I的克列诺片段、T4多核苷酸激酶、和尿嘧啶-DNA糖基化酶；或f.T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I的克列诺片段、T4多核苷酸激酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、和Nb.BbvC1。14.如权利要求1所述的方法，其中使所述样品在步骤(c)经受依序加热程序。15.如权利要求14所述的方法，其中所述依序加热程序包括以下步骤：16℃持续第一限定的持续时间，24℃持续第二限定的持续时间，37℃持续第三限定的持续时间，和75℃持续第四限定的持续时间。16.如权利要求1所述的方法，其中所述外源性核酸序列具有侧接所述引物位点中的至少一侧的简并核酸序列。17.如权利要求16所述的方法，其中所述外源性核酸序列具有侧接所述引物位点中的任一侧的简并核酸序列。18.如权利要求16所述的方法，其中将所述外源性核酸序列在初始复制步骤期间合并至所述cfNA中。19.如权利要求16所述的方法，其中所述外源性核酸序列具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列。20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、和DNA连接酶。21.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶。22.如权利要求1所述的方法，其中所述外源性核酸序列是包含双链反向重复序列和单链环的寡核苷酸，并且其中所述样品中的至少一部分的所述cfNA被制成在所述cfNA的5’末端、所述cfNA的3’末端、或所述cfNA的5’末端和3’末端两者处具有平末端。23.如权利要求22所述的方法，其中使所述外源性核酸序列的每条链在所述样品中的至少一部分的所述cfNA上的所述cfNA的5’末端、所述cfNA的3’末端、或所述cfNA的5’末端和3’末端两者处连接至所述cfNA的每条链。24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(d)之前裂解所述单链环。25.如权利要求24所述的方法，其中所述外源性核酸序列具有SEQIDNO:10的序列。26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA多核苷酸激酶、和尿嘧啶-DNA糖基化酶。27.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I的克列诺片段、T4多核苷酸激酶、和尿嘧啶-DNA糖基化酶。28.如权利要求1所述的方法，其中所述外源性核酸序列是包含双链反向重复序列和单链环的寡核苷酸，并且其中所述样品中的至少一部分的所述cfNA被制成在所述cfNA的3’末端或者5’末端中的至少一者上具有尾序列。29.如权利要求28所述的方法，其中使所述外源性核酸序列的每条链在所述样品中的至少一部分的所述cfNA上的所述cfNA的5’末端、所述cfNA的3’末端、或所述cfNA的5’末端和3’末端两者处连接至所述cfNA的每条链。30.如权利要求29所述的方法，其中在步骤(d)之前裂解所述单链环。31.如权利要求30所述的方法，其中所述外源性核酸序列具有SEQIDNO:9或SEQIDNO:7的序列。32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含具有5’-3’聚合酶活性且具有或不具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA多核苷酸激酶、和尿嘧啶-DNA糖基化酶。33.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述酶混合物包含T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I的克列诺片段、T4多核苷酸激酶、和尿嘧啶-DNA糖基化酶。34.如权利要求1所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶辰雄，
申请(专利权)人：环基因治疗诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US