一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法。该微流控芯片所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口和液体流路通道出口；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道、气路通道、液滴生成单元组成。该方法引入了气压可控的气体流路通道，可形成负压流路通道并自动将单细胞悬液吸入捕获阱，便于观察、检测单细胞的增殖、分化以及药物反应等行为。本发明专利技术利用液滴微流控技术和流体力学原理实现单细胞的高通量自动捕获，相比于传统的单细胞捕获方法，具有操作简便、灵活、高通量、无污染、适用范围广以及可扩展性强等优点。

A high throughput automatic capture of single cells based on droplet microfluidic chip

The invention provides a high-throughput automatic capture of single cells based on a droplet microfluidic chip. The microfluidic chip is composed of two layers, the upper layer is the flow channel entry layer, the lower layer is the flow control layer, and the flow path entry and exit layer has the liquid channel entrance and the liquid channel outlet, and the flow path control layer is composed of single cell capture flow channel, gas channel and droplet generating unit. The method introduces a gas flow channel with controlled air pressure, which can form a negative pressure flow channel and automatically suck the single cell suspension into the trap, so as to observe and detect the proliferation, differentiation and drug reaction of the single cell. The invention uses the liquid drop micro flow control technology and the fluid mechanics principle to realize the high throughput automatic capture of the single cell. Compared with the traditional single cell capture method, it has the advantages of simple operation, flexibility, high throughput, no pollution, wide application and strong extensibility.

【技术实现步骤摘要】
一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法
本专利技术属于微流控技术与细胞生物学的交叉领域，具体涉及一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法。
技术介绍
微流控芯片实验室早期致力于芯片电泳的研究，并提出了微全分析系统(μ-TAS)的概念，研究工作主要集中在连续流微流控系统。近年来，微流控芯片领域出现了一个新的分支-非连续流微流控系统，即液滴微流控系统。液滴微流控系统使用不相溶的两相流体在微孔道界面处形成液滴，这类液滴的体积通常在纳升至皮升(10-9～10-12L)范围。相对于连续流系统，液滴具有体积小、低扩散、无交叉污染、快速的反应动力学等特点，并且具有高通量分析的潜力。经过几年的发展，液滴的制备技术已日趋成熟；同时，液滴的分裂、融合、混合、分选、存储和编码等丰富多样的操控技术也都有广泛的报道。单细胞水平的生物物理特性表征，可有效阐明细胞的功能和状态，揭示细胞的单体差异性，对于细胞的分化和病理研究，以及疾病的早期临床诊断和治疗具有非常重要的意义，目前已成为研究的热点之一。由于细胞极小，直径一般为5～500μm，组分含量少，种类繁多，使得操纵和分析难度很大。早期的单细胞研究，主要采用膜片钳、细胞穿刺等技术，同时借助显微镜三维微操作器进行操作。毛细管电泳分离方法具有进样体积小、分离效率高、分离速度快等优点，已用于单细胞多组分的检测，取得了一些成果。但毛细管属一维结构，进样和溶膜操作复杂。传统的流式细胞仪虽已实现集成化和自动化，但同样具有仪器体积大、内部结构复杂、易损坏等缺点。近年来，随着液滴微流控技术的迅速发展，其在单细胞分析中的应用引起了越来越多的关注。液滴作为单细胞微反应器，能够有效控制扩散，提高检测灵敏度，已被成功应用于多种单细胞分析中。然而，在微流控系统内研究单细胞，首要解决的问题就是如何对单细胞进行捕获，以实现单细胞的移动、固定等，然后才能对其进行分析和检测。目前，已发展出多种单细胞捕获技术，其驱动力主要包括流体压力、电动力、磁力、光学陷阱以及机械力等。其中，由于外部电学原件、磁力控制部件、光学传感器和机械控制器结构复杂，成本偏高，不便广泛应用。利用物理屏障捕获单细胞简单且成本低廉，但容易造成细胞损伤且不便于加载动态生化信号刺激。因此迫切需要一种能够长期捕获悬浮培养单细胞、减少细胞损伤且便于加入药物刺激的单细胞捕获微流控芯片。本专利技术利用液滴微流控技术和流体力学实现单细胞的高通量自动捕获，通过在芯片通道内部形成负压，将单细胞悬液自动吸入单细胞捕获流路通道，通过单细胞捕获阱后，单细胞截留于生成的液滴中，实现单细胞自动捕获；通过调节单细胞悬液流速和单细胞悬液密度控制单细胞捕获率。整个装置结构简单，无需任何复杂和昂贵的设备，可实现高通量，操作方便自动化。因此，本专利技术提供了一种灵活可控的高通量自动捕获单细胞的方法，并期望在细胞学、药物毒理学研究等领域得到应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法，本专利技术制备过程稳定，操作简单，可实现快速、高效、高通量、自动捕获单细胞。一种液滴微流控芯片，所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口和液体流路通道出口；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道、气路通道、液滴生成单元(单细胞捕获阱)组成；所述单细胞捕获流路通道是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口和液体流路通道出口，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元。所述芯片抽真空后，气路通道处于负压状态，由于PDMS的透气性，气路带动周围的液路通道形成负压，可自动将单细胞悬液从液路通道入口吸入，用于单细胞进液和捕获。所述单细胞捕获流路通道宽100～300μm，U型通道的直通道长为40～50mm，直通道间距为0.5～1mm。所述气路通道宽为200～500μm，长为40～50mm，间距为0.5～1mm。所述单细胞捕获流路通道与气路通道间距为0.5～1.5mm。所述液滴生成单元为圆柱形凹陷小坑结构，共有6000～10000个，小坑直径为15～45μm，高80～200μm，小坑间距80～150μm。一种液滴微流控芯片的制备方法，所述芯片制备步骤如下：(1)采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板：所述SU-8模板由双层结构组成，第一层由单细胞捕获流路通道和气路通道组成，第二层由液滴生成单元组成；SU-8模板的制备经过两次甩胶、前烘、曝光、后烘后，一次显影、坚膜得到；(2)基于SU-8模板制得得的PDMS模块：将PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，浇注于SU-8模板，75～85℃烘箱固化30～60min，将PDMS与SU-8模板剥离，得到带有结构的上层芯片；将上层芯片与带有流路出入口的下层芯片经过等离子体处理1～4min后封接。一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法，采用上述液滴微流控芯片，按照以下步骤进行：将上述制备的微流控芯片经60～90％乙醇浸泡，紫外照射30～60min灭菌处理后，将液体流路通道出口堵住，置于真空培养箱抽真空5～10min，随后，快速将单细胞悬液以5×103cells/mL～5×106cells/mL的细胞密度加入芯片入口，控制单细胞悬液流速在0.01m/s～0.05m/s之间，待全部液滴生成单元都充满单细胞悬液时，打开液体流路通道出口，将液体流路通道中多余液体排除，待细胞粘附于芯片底面，补加新鲜的高糖DMEM培养基，置于37℃培养箱培养。一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法的应用，所捕获的单细胞可在芯片的液滴结构中长期培养，并可应用于细胞增殖、分化以及药物筛选等方面。本专利技术利用液滴微流控技术和流体力学原理实现单细胞的高通量自动捕获，相比于传统的单细胞捕获方法，具有操作简便、灵活、高通量、无污染、适用范围广以及可扩展性强等优点。本专利技术期望提供一种灵活可控的单细胞捕获方法，并且在细胞学、药物毒理学研究等领域得到应用。附图说明：图1：芯片结构示意图；(a)整体结构图，(b)为局部放大图；图2：微流控芯片侧面局部放大图。其中：1为液体流路通道入口，2为液体流路通道出口，3为单细胞捕获流路通道，4为气体流路通道，5为液滴生成单元(单细胞捕获阱)，6为单细胞；图3：微流控芯片实物图。图4：单细胞悬液密度为5×104cells/mL时，芯片中的单细胞分布图。图5：单细胞悬液密度为5×105cells/mL时，芯片中的单细胞分布图。具体实施方式一种高通量自动捕获单细胞的微流控芯片，如图1、图2、图3所示；所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口1和液体流路通道出口2；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道3、气路通道4、液滴生成单元(单细胞捕获阱)5组成；所述单细胞捕获流路通道3是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口1和液体流路通道出口2，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道4，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元5。所述单细胞捕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液滴微流控芯片，其特征在于所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口(1)和液体流路通道出口(2)；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道(3)、气路通道(4)、液滴生成单元(5)组成；所述单细胞捕获流路通道(3)是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口(1)和液体流路通道出口(2)，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道(4)，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元(5)。

【技术特征摘要】
1.一种液滴微流控芯片，其特征在于所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口(1)和液体流路通道出口(2)；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道(3)、气路通道(4)、液滴生成单元(5)组成；所述单细胞捕获流路通道(3)是一条由多个交互连接的U型通道构成的长通道，长通道两端分别连接液体流路通道入口(1)和液体流路通道出口(2)，每个U型通道的直通道均有与之平行的气体流路通道(4)，每个U型通道的直通道上分布着数个圆柱形凹陷小坑结构的液滴生成单元(5)。2.按照权利要求1所述一种液滴微流控芯片，其特征在于：所述单细胞捕获流路通道宽100～300μm，U型通道的直通道长为40～50mm，直通道间距为0.5～1mm。3.按照权利要求1所述液滴微流控芯片，其特征在于：所述气路通道宽为200～500μm，长为40～50mm，间距为0.5～1mm。4.按照权利要求1所述液滴微流控芯片，其特征在于：所述单细胞捕获流路通道与气路通道间距为0.5～1.5mm。5.按照权利要求1所述液滴微...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，张晓庆，姜雷，苏文涛，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21