用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基及其用法制造技术

本发明专利技术公开了一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，各组分含量如下，葡萄糖1000‑6000；丙酮酸钠50‑200；精氨酸50‑300；天冬氨酸5‑30；谷氨酰胺300‑1500；赖氨酸100‑200；甲硫氨酸30‑80。本发明专利技术具有以下优点和效果：培养基采用无血清的培养基，葡萄糖、维生素、胸苷等提供Hi5细胞及猪圆环病毒增殖所需的营养成分，培养基内加入硫酸软骨素、丝肽、软骨黏连蛋白等，促进Hi5细胞在无血清的培养基内生长和增殖，提高Hi5细胞的存活率；将能表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒接种Hi5细胞后，Hi5细胞能对外源基因的高表达性能，表达PCV2 Cap蛋白，用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，无血清，Hi5细胞生长良好，且能高表达外源基因，制备得到的PCV2 Cap蛋白质量稳定、安全。

【技术实现步骤摘要】
用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基及其用法
本专利技术涉及动物疫苗制备
，特别涉及一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基及其用法。
技术介绍
猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一，病毒粒子直径14-17nm,无囊膜。猪圆环病毒包括PCV1和PCV2两个血清型，PCV1为非致病的病毒，PCV2为致病性的病毒，成为危害养殖业的重要病毒之一。PCV2基因组为单链闭合环状DNA，全长1767bp或1768bp，含有ORF1和ORF2两个主要的开放阅读框，其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒的结构蛋白(Cap)。Cap蛋白为PCV2的主要免疫性蛋白，可以刺激机体产生中和抗体，清除体内病毒并使机体免受病毒损伤，单独的Cap蛋白可以自我组装成病毒样颗粒，由于不含病毒基因组，不能复制，但依然可以刺激机体产生抗体，大大提高了疫苗使用的安全性。现有技术中已出现能表达PCV2的Cap蛋白的重组杆状病毒，如张永武等人公开于“动物医学进展”2016,37(3)：14-18上的文献“表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定”。重组杆状病毒需要转染SF9细胞后进行传代，获得含有Cap蛋白的病毒液，以用作猪圆环亚单位疫苗。但是上述文献中在Cap蛋白表达过程中存在以下问题：昆虫细胞杆状病毒表达载体系统是继大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞之后的基因工程表达载体系统，主要包括SF9细胞系和Hi5细胞系，Hi5细胞系即粉纹夜蛾卵巢细胞系。SF9细胞系外源基因表达性能较弱，用于工业大规模生产时，成本较高，无法实现批量生产。Hi5细胞系虽然具有外源基因表达性能高的作用，但是现有技术中还没有出现用于Hi5细胞转染重组杆状病毒后表达Cap蛋白的培养体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，包括以下组分，单位以毫克/升计，各组分含量如下，葡萄糖1000-6000；丙酮酸钠50-200；精氨酸50-300；天冬氨酸5-30；谷氨酰胺300-1500；赖氨酸100-200；甲硫氨酸30-80；色氨酸5-20；丝氨酸5-20；生物素0.001-0.2；叶酸2-5；烟酰胺2-10；硫胺素2-10；硫酸铜5-20；硫酸铁0.1-2；硫酸镁10-50；硫酸软骨素30-40；丝肽20-50；氯化钠200-300；氯化钾250-400；磷酸氢二钠100-150；磷酸二氢钠100-150；亚硒酸钠20-50；豆蔻酸0.01-0.2；棕榈酸0.01-0.1；棕榈油酸0.01-0.03；转铁蛋白10-60；胰岛素10-50；表皮生长因子10-30；白蛋白10-40；软骨黏连蛋白20-40；艾杜糖醛酸5-30；亚麻酸10-20；油酸10-20；卵磷脂10-20；棉子糖10-25；水苏糖20-30。通过采用上述技术方案，动物细胞培养基，多需要加入动物血清，以提供动物细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支撑蛋白。但是培养基内加入动物血清存在以下问题，动物血清成分复杂，难以确定，生产出来的动物疫苗质量和安全不易控制。用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基内的组分分为以下几类，基础营养物质、维生素、无机盐、补充因子，基础营养物质包括葡萄糖、精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丝氨酸、亚麻酸、油酸、棉子糖、水苏糖等，提供动物细胞生长所需的营养物质，维生素包括叶酸、生物素、硫胺素，无机盐包括硫酸铜、硫酸铁、硫酸镁、氯化钠、氯化钾，为动物细胞的生长增殖提供无机盐组分；补充因子包括胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白、表皮生长因子、硫酸软骨素、艾杜糖醛酸、丝肽，硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，发挥着许多重要的生理功能。硫酸软骨素加入到培养基内，起到促进Hi5细胞生长增殖、提高Hi5细胞外源基因表达以促进Cap蛋白合成的作用；艾杜糖醛酸是艾杜糖的C-6位上的羟基氧化为羧基而形成的衍生物，是几种糖胺聚糖的组分，艾杜糖醛酸加入到培养基内后，能促进接种猪圆环病毒的Hi5细胞增殖、生长及提高Hi5细胞外源性基因表达以促进Cap蛋白合成的作用；丝肽是丝蛋白的降解产物，呈透明的淡黄色液体，分子量约在300-5000之间，当培养基内去除动物血清后，Hi5细胞在生长增殖过程中，容易受到机械因素、化学因素的影响，丝肽加入到培养基内后，能起到保护Hi5细胞的作用，减少Hi5细胞在生长、增殖过程中受到环境因素的影响。本专利技术的进一步设置为：还包括以下组分，单位为毫克/升，胸苷0.2-2；氯化镁200-500；氯化钙150-300。通过采用上述技术方案，胸苷、氯化镁、氯化钙为Hi5细胞、猪圆环病毒增殖提供营养组分。本专利技术的进一步设置为：包括以下组分单位为毫克/升，丙氨酸4-9；胱氨酸5-50；谷氨酸3-40；甘氨酸3-30；组氨酸2-10；异亮氨酸20-30；苯丙氨酸20-50；脯氨酸10-30；苏氨酸10-20；色氨酸20-30；酪氨酸10-20；缬氨酸30-130。通过采用上述技术方案，丙氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸为Hi5细胞生长增殖、猪圆环病毒增殖提供营养组分。本专利技术的进一步设置为：还包括以下组分，单位为毫克/升，海藻酸钠20-40。通过采用上述技术方案，海藻酸钠是一种多糖，能为Hi5细胞的增殖提供营养物质，其次，海藻酸钠具有一定的粘附性，提高Hi5细胞外源基因表达以促进Cap蛋白的合成，减少Hi5细胞在无血清的培养基中的死亡。本专利技术的进一步设置为：还包括以下组分，单位为毫克/升，花色苷20-50；羟丁酸钠5-10。通过采用上述技术方案，花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，安全无毒，结构中有多个酚羟基，属于羟基供体，且能起到抗氧化的作用，对于羟自由基、超氧自由基等均有很好的清除作用，可防止大分子物质的氧化损伤，在培养基内起到保护Hi5细胞及大分子物质的作用；羟丁酸钠加入到培养基内，能提高花色苷对Hi5细胞的保护作用，提高Hi5细胞在无血清的培养基内的存活率。本专利技术的进一步设置为：还包括以下组分，单位为毫克/升，L-岩藻糖10-30。通过采用上述技术方案，L-岩藻糖在提供营养成分的同时，提高Hi5细胞的存活率，且提高Hi5细胞外源基因表达以促进Cap蛋白的合成。本专利技术的进一步设置为：还包括以下组分，单位为毫克/升，核黄素20-30；腺嘌呤20-40；吡哆醇5-10；吡哆醛5-10；吡哆胺5-10。通过采用上述技术方案，培养基内还包括核黄素、腺嘌呤、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基的使用方法，步骤一，将用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基置于生物反应器内，接种Hi5细胞后以灌流培养的方式培养Hi5细胞；步骤二，取表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒和转染剂混合后，转染对数生长期的SF9细胞，培养细胞直至细胞出现变大、漂浮及破裂的细胞病变特征时收集细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：包括以下组分，单位以毫克/升计，各组分含量如下

【技术特征摘要】
1.一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：包括以下组分，单位以毫克/升计，各组分含量如下2.根据权利要求1所述的一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：还包括以下组分，单位为毫克/升，胸苷0.2-2；氯化镁200-500；氯化钙150-300。3.根据权利要求2所述的一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：包括以下组分，单位为毫克/升，4.根据权利要求1所述的一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：还包括以下组分，单位为毫克/升，海藻酸钠20-40。5.根据权利要求1所述的一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在于：还包括以下组分，单位为毫克/升，花色苷20-50；羟丁酸钠5-10。6.根据权利要求1所述的一种用于Hi5细胞制备猪圆环亚单位疫苗的培养基，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒建洪，陈健，何玉龙，王泽宇，
申请(专利权)人：杭州洪晟生物技术股份有限公司，浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33