本发明专利技术涉及一种GFP‑2小肽及其制备方法和应用，该小肽通过以下方法制备得到：（1）配制红糖培养基，灭菌处理；（2）接GFP‑2菌，甘油菌与LB培养基接菌，摇床培养；（3）转接到红糖培养基中，进行摇床培养，然后进行离心，收集上清，弃菌体；（4）盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，去除上清，收集粗蛋白；（5）用tris‑HCl重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过膜，用tris‑HCl进行透析；（6）用超滤管进行超滤，收集分子量小于10KD的小肽，将所得小肽冷却，冻干得到GFP‑2小肽。所制得的小肽可以作为佐剂，能够大幅提高免疫效力。
【技术实现步骤摘要】
一种GFP-2小肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物技术制药工程
，尤其涉及一种来源海洋芽孢杆菌GFP-2的小肽佐剂制备方法，以及该小肽在提高疫苗的免疫效力中的应用。
技术介绍
接种疫苗是预防和治疗传染病的最具成本效益的方法，疫苗的足够的免疫原性和安全性是该领域最重要的关注点。虽然传统疫苗如活的，减毒有机体和杀灭或灭活的有机体通常具有更高的免疫原性，但存在有限的回复毒力的潜在风险。另外，这些疫苗不稳定且安全性低。与传统的疫苗相比，DNA疫苗，重组疫苗以及亚单位疫苗等新型疫苗相对安全。但是，这些疫苗的也存在一定的缺陷，最大的缺陷之一就是免疫原性往往较低，不能达到免疫机体的功效，往往需要加入佐剂或者递送的载体来提高其免疫效力。免疫佐剂广义上是指免疫系统的调节剂,能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,能增强该抗原的免疫原性或改变免疫反应类型,而本身并无抗原性的物质。因此开发具有高潜力的安全有效的佐剂来加强特异性免疫应答就非常重要。
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术所要解决的技术问题是免疫原性往往较低，不能达到免疫机体的功效的问题，克服LB培养基的不足，采用红糖培养基扩大培养GFP-2菌，并提供一种小肽的制备方法，该培养基可使小肽的表达量增大，更利于工业化生产，且小肽成功表达并分泌到培养基中，有利于小肽的制备纯化，有利于保持小肽的活性。用于解决问题的方案为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是提供了一种GFP-2小肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：一种GFP-2小肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）配制红糖培养基，灭菌处理；（2）接GFP-2菌，甘油菌与LB培养基接菌，摇床培养；（3）转接到红糖培养基中，进行摇床培养，然后进行离心，收集上清，弃菌体；（4）盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，去除上清，收集粗蛋白；（5）用tris-HCl重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过膜，用tris-HCl进行透析；（6）用超滤管进行超滤，收集分子量小于10KD的小肽，将所得小肽冷却，冻干得到GFP-2小肽。优选的，步骤（1）中，配制0.8-1.2L红糖培养基，100-120℃灭菌10-20min；步骤（2）中，接GFP-2菌，每管3-10mLLB培养基，甘油菌与培养基按照1：50-150的比例接菌，共接2管GFP-2菌液，摇床培养，8-15h。优选的，步骤（3）中，转接到0.5-1.5L的红糖培养基中，摇床培养8-15h；2000-6000rpm离心0.5-3h，收集上清，弃菌体。优选的，步骤（4）中，上清与饱和硫酸铵溶液按照2-5：1的比例进行盐析，使得蛋白及小肽析出；盐析过后再次进行离心，10000-150000rpm离心5-30min，去除上清，收集粗蛋白。优选的，步骤（5）中，用tris-HCL重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过0.45mm的滤膜，用tris-HCl透析3-8h,每隔0.5-2h换一次tris-HCl。优选的，步骤（6）中，用10KD的超滤管4000-8000rpm超滤20-60min，收集分子量小于10KD的小肽，将收集的液体小肽放入-80℃冰箱0.5-2h,然后将固体小肽放入冻干机冻干成冻干粉保存。本专利技术还提供了一种GFP-2小肽，所述小肽是采用上述技术方案所制备得到的GFP-2小肽。优选的，所述小肽的分子量小于10KD。本专利技术的另一目的是提供一种具备免疫增强剂效力的小肽，该小肽是由GFP-2分泌，分子量为10kD的混合小肽。本专利技术的再一目的是提供一种上述小肽在制备疫苗、免疫调节剂或治疗药物中的应用。专利技术的效果本专利技术提供了一种GFP-2小肽及其制备方法，该小肽可以作为佐剂，大幅提高免疫效力，加强特异性免疫应答，显著提高抗体效价。具体实施方式首先，本专利技术提供了一种GFP-2小肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）配制红糖培养基，灭菌处理；（2）接GFP-2菌，甘油菌与LB培养基接菌，摇床培养；（3）转接到红糖培养基中，进行摇床培养，然后进行离心，收集上清，弃菌体；（4）盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，去除上清，收集粗蛋白；（5）用tris-HCl重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过膜，用tris-HCl进行透析；（6）用超滤管进行超滤，收集分子量小于10KD的小肽，将所得小肽冷却，冻干得到GFP-2小肽。在本专利技术的上下文中，术语“GFP”是绿色萤光蛋白Greenfluorescentprotein的简称，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，GFP-2是一种来源海洋的芽孢杆菌。在本专利技术的上下文中，术语“LB培养基”是指LB（Luria-Bertani）液体培养基，其可以由常规的方法配制得到，例如可通过以下方法进行配制（1L）：在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨（tryptone）10g；酵母提取物（yesatextract）5g；NaCl10g。用1M的NaOH调节pH值到7.0，用去离子水定容至1L，121℃，20min高压灭菌，即得。在本专利技术的上下文中，术语“tris-HCl”为tris与HCl的缓冲溶液，其中tris为三羟甲基氨基甲烷。以下结合实施例对本专利技术作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有说明，本专利技术使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。本专利技术实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程
的市售产品。本专利技术的一项实施方式是提供了一种GFP-2小肽，所述小肽是采用上述一种或或多种实施方式所制备得到的GFP-2小肽。在一项优选的实施方案中，所述小肽的分子量小于10KD。本专利技术的一项实施方式是提供一种具备免疫增强剂效力的小肽，该小肽是由GFP-2分泌，分子量为10kD的混合小肽。本专利技术的再一实施方式是提供一种上述小肽在制备疫苗、免疫调节剂或治疗药物中的应用。以下结合实施例对本专利技术作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有说明，本专利技术使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。本专利技术实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程
的市售产品。实施例1GFP-2小肽的制备（1）配1L红糖培养基，110℃灭菌15min；（2）接GFP-2菌，每管5mLLB培养基，甘油菌与培养基按照1：100的比例接菌。共接2管GFP-2菌液，摇床培养12h；（3）转接到1L的红糖培养基中，摇床培养12h，4000rpm离心1h，收集上清，弃菌体；（4）配制饱和硫酸铵，上清与饱和硫酸铵按照4：1的比例进行盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，12000rpm离心20min，去除上清，收集粗蛋白（5）用tris-HCL重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过0.45mm的滤膜，用tris-HCL透析5h,每隔1h换一次tris-HCL；（6）用10KD的超滤管6000rpm超滤35min，收集分子量<10KD的小肽，将收集的液体小肽放入-80℃冰箱1h,然后将固体小肽放入冻干机冻干成冻干粉保存。实施例2GFP-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种GFP‑2小肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）配制红糖培养基，灭菌处理；（2）接GFP‑2菌，甘油菌与LB培养基接菌，摇床培养；（3）转接到红糖培养基中，进行摇床培养，然后进行离心，收集上清，弃菌体；（4）盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，去除上清，收集粗蛋白；（5）用tris‑HCl重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过膜，用tris‑HCl进行透析；（6）用超滤管进行超滤，收集分子量小于10KD的小肽，将所得小肽冷却，冻干得到GFP‑2小肽。
【技术特征摘要】
1.一种GFP-2小肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）配制红糖培养基，灭菌处理；（2）接GFP-2菌，甘油菌与LB培养基接菌，摇床培养；（3）转接到红糖培养基中，进行摇床培养，然后进行离心，收集上清，弃菌体；（4）盐析，使得蛋白及小肽析出，盐析过后再次进行离心，去除上清，收集粗蛋白；（5）用tris-HCl重悬粗蛋白，并将重悬的粗蛋白过膜，用tris-HCl进行透析；（6）用超滤管进行超滤，收集分子量小于10KD的小肽，将所得小肽冷却，冻干得到GFP-2小肽。2.如权利要求1所述的一种GFP-2小肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，配制0.8-1.2L红糖培养基，100-120℃灭菌10-20min；步骤（2）中，接GFP-2菌，每管3-10mLLB培养基，甘油菌与培养基按照1：50-150的比例接菌，共接2管GFP-2菌液，摇床培养，8-15h。3.如权利要求1所述的一种GFP-2小肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，转接到0.5-1.5L的红糖培养基中，摇床培养8-15h；2000-6000rpm离心0.5-3h，收集上清，弃菌体。4.如权利要求1所述的一种GFP-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕正兵，舒建洪，王丹，
申请(专利权)人：杭州洪晟生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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