一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，该方法采用RT‑qPCR技术对不同条件下发酵过程中木糖启动子基因转录水平进行实时检测，并据检测结果提出木糖诱导型地衣芽孢杆菌诱导产蛋白的方法。本发明专利技术依据启动子转录水平提供的诱导方法可以从基因表达最基础的层面指导木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌产蛋白，满足实际生产的不同诱导需求；此外，该方法也可以应用于不同的宿主菌产不同蛋白的研究，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种发酵培养过程中地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法。
技术介绍
地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是从土壤和植物表面分离的一种革兰氏阳性的腐生性芽孢杆菌。作为一种GRAS(Generallyrecognizedassafe)微生物，其培养需求简单、耐热、酶系丰富、产酶量高等优良特性，显示了该菌种巨大的工业应用潜力。地衣芽孢杆菌应用于工业化生产主要采取组成型表达机制在启动子的作用下持续合成自身的蛋白酶或淀粉酶等，但组成型表达并不适合宿主外源基因的高效表达。而诱导型表达可以拓宽这一优良宿主的应用领域，适合不同蛋白产品的表达，另外，诱导型表达机制可使生长与表达可控，并可能使两者的效率最大化。在已经研究发现的芽孢杆菌内源诱导性表达调控机制中，木糖异构酶的启动子及其阻遏蛋白所组成的木糖诱导系统在表达效率，严谨性及经济性方面均更具优势。然而，传统诱导工艺对不同蛋白的诱导条件不具普遍性，只能通过蛋白产量进行条件摸索，况且当表达的蛋白不好检测时，这种摸索方法更加表现为周期长、效率低、进步缓慢。因此，通过对地衣芽孢杆菌木糖操纵子在不同条件下发酵过程中转录强度的动态考察，可以为地衣芽孢杆菌以木糖操纵子为元件表达不同蛋白提供科学的依据，从而制定发酵策略。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人为了克服现有诱导条件优化存在的缺陷，提供了一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，以满足实际生产的不同需求。本专利技术的技术方案如下：一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，采用RT-qPCR技术对不同条件下发酵过程中木糖启动子基因转录水平进行实时检测，并据检测结果提出木糖诱导型地衣芽孢杆菌诱导产蛋白的方法。一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，所述方法包括以下步骤：(1)将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种至种子培养基，培养至一定菌浓；(2)按照3％的接种量将培养好的种子转接至发酵培养基；(3)DNS法控制发酵过程葡萄糖浓度在目标浓度范围内；(4)发酵过程实时取样，提取总RNA，进行反转录、qPCR、分析转录水平以指导目的蛋白诱导工艺。步骤(1)中所述种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，接种量为200μL；所述培养条件为37℃，250r/min，；所述菌浓为OD600达到7±0.5；所述地衣芽孢杆菌为模式菌株Bacilluslicheniformis9945a。步骤(2)中所述发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨FP32120，酵母粉FM40810，玉米浆干粉5，K2HPO4·3H2O9.12，KH2PO41.36，CaCl20.5，MgSO4·7H2O0.5。步骤(3)中所述DNS法为控糖方法，具体过程为：发酵前，预先测定特定糖浓度的OD540值，以此为对照，以对照扣除测定的值即耗糖量，通过耗糖的值计算残糖，当培养基中存在木糖时，忽略木糖的消耗量，仍以此方法控制发酵过程中葡萄糖含量；所述目标浓度分别为：0、20、50、80、120、180、200g/L。DNS测定的糖浓度需最后经HPLC检测。步骤(4)中所述实时取样的样品应保藏于-70℃，待发酵结束立即提取RNA，反转录为cDNA后，以此为模板进行qPCR，进而获得发酵过程中木糖启动子的转录数据，分析转录水平以指导目的蛋白诱导工艺。所述cNDA浓度为200ng/μL，qPCR10μL体系，cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa说明书提供体系，通过Origin软件对获得的数据进行处理、分析。将发酵过程制得的发酵液在12000r/min下冷冻离心10min，取100μL上清液，加入100μL浓度为10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3h以上，12000r/min离心20min，取100μL上清液装液相小瓶，设置进样量10μL进样，采用示差检测器检测产物。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术所提供的诱导方法，可以从基因表达最基础的层面指导木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌产蛋白，提高目标基因的转录水平，满足实际生产的不同诱导需求。此外，该方法也可以应用于不同的宿主菌产不同蛋白的研究，具有良好的应用前景。附图说明图1为实施例1地衣芽孢杆菌发酵过程生长及糖耗曲线；图2为实施例1地衣芽孢杆菌木糖诱导启动子在不同时间点的转录水平；图3为实施例1地衣芽孢杆菌在不同葡萄糖浓度条件下发酵过程生长及糖耗曲线；图中：■—■：OD600；○—○：葡萄糖浓度；▲—▲：木糖浓度；A：50g/L；B：80g/L；C：120g/L；D：180g/L；E：200g/L；F：0g/L；生长曲线有菌体量下降的情况是补糖对发酵液稀释的结果。图4为实施例3地衣芽孢杆菌木糖诱导启动子在不同温度下的转录水平图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。下述实施例中：(1)种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10；(2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨FP32120，酵母粉FM40810，玉米浆干粉5，K2HPO4·3H2O9.12，KH2PO41.36，CaCl20.5，MgSO4·7H2O0.5(3)菌密度OD600使用紫外分光光度计测定；(5)DNS法：发酵前，预先测定特定糖浓度的OD540值，以此为对照，以对照扣除测定的值即耗糖量，通过耗糖的值计算残糖，当培养基中存在木糖时，忽略木糖的消耗量，仍以此方法控制发酵过程中葡萄糖含量；(6)HPLC检测：将发酵液在12000r/min下冷冻离心10min，取100μL上清液，加入100μL浓度为10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3h以上，12000r/min离心20min。取100μL上清液装液相小瓶，设置进样量10μL进样，采用示差检测器检测产物；(7)RNA提取使用天根细菌/细胞总RNA提取试剂盒；反转录、qPCR试剂均使用TaKaRa试剂盒。实施例1不同生长阶段诱导方法将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种200μL至种子培养基，37℃，250r/min培养12h，此时OD600约7.0左右。活化好的种子转接3％至发酵培养基中，初始碳源为30g/L葡萄糖和10g/L木糖，于37℃，250r/min进行培养。发酵过程中每隔2-4h取样测菌体量、残糖，DNS法控制葡萄糖浓度在20g/L左右，并留样至-70℃保藏。发酵结束后对在线采集的样品进行总RNA提取，将RNA反转录为cDNA，cNDA稀释至200ng/μL左右，以此为模板进行qPCR反应，qPCR体系为10μL，其中cDNA加样量0.5μL，其余均按TaKaRa说明书提供体系，qPCR反应使用BIO-RADCFX96仪进行。同时，对在线采集的样品进行HPLC检测，以准确获知发酵过程中糖浓度的变化情况。根据所述方法获得地衣芽孢杆菌发酵过程生长及糖耗曲线图(图1)和木糖诱导启动子在不同时间段的转录水平图(图2)；由图1、2结果可见，以地衣芽孢杆菌为宿主的木糖诱导系统转录强度在菌体对数生长末期最强，由此得出，当实际生产需要维持较高菌体时，在对数生长末期小范围时间内诱导效果较好；当实际生产需要维持较高产量时，在对数生长末期较为宽泛的范本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，其特征在于，采用RT‑qPCR技术对不同条件下发酵过程中木糖启动子基因转录水平进行实时检测，并据检测结果提出木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白诱导方法。

【技术特征摘要】
1.一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法，其特征在于，采用RT-qPCR技术对不同条件下发酵过程中木糖启动子基因转录水平进行实时检测，并据检测结果提出木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白诱导方法。2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将甘油管保藏的地衣芽孢杆菌接种至种子培养基，培养至一定菌浓；(2)按照3％的接种量将培养好的种子转接至发酵培养基；(3)DNS法控制发酵过程葡萄糖浓度在目标浓度范围内；(4)发酵过程实时取样，提取总RNA，进行反转录、qPCR、分析转录水平以指导目的蛋白诱导工艺。3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，接种量为200μL；所述培养条件为37℃，250r/min，；所述菌浓为OD600达到7±0.5；所述地衣芽孢杆菌为模式菌株Bacilluslicheniformis9945a。4.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨FP32120，酵母粉FM40810，玉米浆干粉5，K2HPO4·3H2O9.12，KH2PO41.36，CaCl20.5，MgSO4·7H2O0.5。5.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，李由然，刘翔，张梁，丁重阳，徐沙，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32