本发明专利技术涉及生化检测领域，尤其是涉及一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法。该检测体系、试剂盒和检测方法包括扩增引物系统和分子信标探针系统，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，所述分子信标探针系统包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。与细菌培养、SAT和RBPT等血清学试验相比，能够提高检测效率，并且特异性好、灵敏度高，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系
本专利技术涉及生化检测领域，尤其是涉及一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，导致动物的繁殖障碍和人类的发热性疾病，并且在中东、西亚、非洲和南美等地区流行。在过去的几十年中，中国特别是新疆和内蒙古的人类布鲁氏菌病患病率显着增加。基于使用一系列细菌学和生物化学测试的单一表型特征，布鲁氏菌通常分为六种。近年来，由于从海洋哺乳动物、啮齿动物和感染的人类乳房植入物中分离出几种新的布鲁氏菌菌株，物种数量已增加到10。人体中的布鲁氏菌病具有多种临床症状，其中最重要的是断续不稳定的发热和动脉痛。大部分患者伴有脾肿大和/或肝肿大。当疾病变为慢性时，它会影响几乎所有器官并导致复杂的综合征，包括脊椎炎、心内膜炎和脑膜脑炎等。一般来说，布鲁氏菌病的诊断方法包括直接微生物分析和间接检测，如血清学检测。细菌培养是疾病决定性诊断的重要标准，但需要较长时间，灵敏度较低。血清学检测方法如标准凝集试验（SAT）和板式孟加拉红平板凝集实验（RBPT）均为用于检测抗布鲁氏菌抗体，但血清学方法可能被疫苗，反复暴露于抗原刺激，或与布鲁氏菌以外的抗原交叉反应等问题混淆，影响检测的准确性。与细菌培养方法相比，分子测定法是度敏度高的，并且与血清学方法相比更具特异性。PCR方法具有可信度高，成本效益高，灵敏度高，特异高并且检测快速，越来越多地被用作鉴定布鲁氏菌属、种和生物型的特定序列，以及利用它作为减少布鲁氏菌病爆发的监测工具。分子信标（MB）是标记的单链寡核苷酸，具有茎-环结构。环是与其靶序列互补的单菌株，而茎是由5至7bp的两个抗互补臂形成的双菌株以稳定环。一条臂的末端用荧光团标记，另一条臂的末端用淬灭基团连接。环与其靶序列的结合打开了茎并从荧光团中除去了淬灭基团，产生了荧光。MB生成信号仅在目标存在的情况下产生。为了克服检测时产生的误导，需要一种诊断布鲁氏菌感染的新方法。在本研究中，建立并评估了基于分子信标的实时定量PCR方法。通过与细菌培养和血清学试验比较来评估了其诊断价值。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法，能够提高检测效率，并且特异性好、灵敏度高。一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。在一些实施例中，所述分子信标探针系统包括如SEQIDNO.3所示的基因序列。在一些实施例中，所述分子信标探针的两端标记有荧光团和淬灭基团。现在已知的任何荧光团-淬灭基团对可用于本专利技术的实践中。（参见例如S.A.Marras,“Selectionoffluorophoreandquencherpairsforfluorescentnucleicacidhybridizationprobes,”MethodsMol.Biol.2006；335:3-16.）。在一些实施方案中，荧光团的激发波长分别为495nm、538nm或646nm，发射波长分别为520nm、554nm或669nm。在一些实施方案中，淬灭基团是吸收峰为430nm至672nm的染料。在一些实施方案中，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM）、6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一种；所述淬灭基团选自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、IowaBlackFQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、IowaBlackRQ、QSY-21和DHQ-3。在一些实施例中，荧光团选自荧光素亚酰胺（fluoresceinamidite，FAM），淬灭基团选自DABCYL。通常而不总是，淬灭团通过醚键连接到寡核苷酸的3'羟基基团，而荧光团通过酯键连接到寡核苷酸的5'磷酸基团。在一些实施例中，所述分子信标探针系统还包括用FAM（荧光团）和DABCYL（淬灭基团）分别标记SEQIDNO.3所示的基因序列的5'和3'末端。一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒，包括上述任一实施例所述的体系。在一些实施例中，所述基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒还包括PCR常用试剂，例如DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs以及DNATaq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH2O)中的至少一种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。在一些实施例中，所述PCR常用试剂DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs以及DNATaq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。在一些实施例中，所述引物对的使用浓度为10~100pmol/L；优选50pmol/L。在一些实施例中，所述分子信标探针的使用浓度为20~100pmol/L；优选50pmol/L。在一些实施例中，PCR反应缓冲液的成分包括KCl、Tris-HCl、1％TritonX-100，10×的PCR反应缓冲液的使用浓度为0.1~4.5mmol/L；优选1.2mmol/L。在一些实施例中，Mg2+试剂如MgCl2试剂等，Mg2+的使用浓度为0.2~5mmol/L；优选2.0mmol/L。在一些实施例中，dNTPs中各dNTP的使用浓度为0.1~5mmol/L；优选1.0mmol/L。在一些实施例中，DNATaq聚合酶的使用浓度为0.5单位。在一些实施例中，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有布鲁氏菌阳性对照质粒的溶液。可单独市购或根据现有技术自行构建。在一些实施例中，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有布鲁氏菌的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等；阴性对照亦可为含有非相关病原体对照质粒的溶液，例如大肠杆菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、铜绿假单胞菌（ATCC15442）、阴沟肠杆菌（ATCC13047）、产气肠杆菌（ATCC49701）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、屎肠球菌（ATCC29212）等一种或多种的对照质粒溶液。本专利技术的试剂盒采用分子信标实时定量PCR进行布鲁氏菌的检测，根据扩增及检测情况可分析判断布鲁氏菌感染情况。因此，引物及探针的设计是本专利技术试剂盒的关键。一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的检测方法，包括如下步骤：提取待测样本的DNA；以提取的DNA作为模板，以所述扩增引物系统作为扩增引物，并加入分子信标探针系统进行实时荧光PCR扩增；在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。在一些实施例中，所述检测方法中PCR扩增条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
【技术特征摘要】
1.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。2.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统包括如SEQIDNO.3所示的基因序列。3.如权利要求2所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统还包括用荧光团和淬灭基团标记SEQIDNO.3所示的基因序列的5'和3'末端；优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM）、6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一种；优选的，所述淬灭基团选自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、IowaBlackFQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、IowaBlackRQ、QSY-21和DHQ-3中的一种；优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM），所述淬灭基团选自DABCYL，分别标记SEQIDNO.3所示的基因序列的5'和3'末端。4.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒，包括上述任一权利要求所述的体系。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs、DNATaq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH2O)中的至少一种。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的使用浓度为10~100pm...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴国球，舒建洪，吕正兵，何玉龙，童夏霞，杨芳，
申请(专利权)人：杭州洪晟生物技术股份有限公司，杭州洪桥中科基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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