用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒，建立了人类基因组成熟tRNA谱的检测方法。本发明专利技术克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明专利技术的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。

Connectors, primers and kits for detection of mature human genome tRNA spectra

The invention relates to connectors, primers and kits for detecting mature tRNA spectrum of human genome, and establishes a detection method for mature tRNA spectrum of human genome. The invention overcomes the difficulties of redundancy of tRNA detection steps, redundancy of genome coding tRNA and standardization of tRNA expression, and can detect all mature tRNA levels in human genome by conventional qPCR using only the novel connectors and primers of the invention, so as to achieve rapid, accurate and high-throughput detection of the transcription level changes of mature tRNA spectrum.

【技术实现步骤摘要】
用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，涉及tRNA合成生物学、遗传学以及qPCR检测方法学，具体涉及用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒。
技术介绍
tRNA是氨基酸的载体，主要参与遗传密码的识别，是联系基因组遗传信息和蛋白功能的重要分子。目前人类基因组中含有编码415个tRNA基因，由于tRNA分子片段较小，大约在70bp左右，常规方法不能检测此类小RNA分子。此外，还有如下几个原因导致检测这类小RNA分子存在困难：第一、成熟tRNA需通过共价连接氨基酸分子才能行使功能，所以在接头连接之前需要首先去除连接的氨基酸；第二、tRNA具有高度稳定的三叶草结构且含有大量的转录后碱基修饰，因此常规方法不能获得tRNA的cDNA分子；第三、人类基因组编码了冗余的tRNA拷贝，高通量检测所有tRNA十分繁杂；第四，由于tRNA分子短，结构复杂，常规方法获得cDNA步骤冗长，大大限制tRNA检测方法的应用。目前tRNA检测的高通量测序的检测方法已经建立了，但是其试验设备依赖性强、试验周期长、价格昂贵，大大的限制了tRNA生物学的研究。qPCR技术由美国AppliedBiosystems公司于1996年推出，其作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。目前尚没有使用常规qPCR技术实现tRNA检测的相关报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组、试剂盒及应用。本专利技术还提供了相应的人类基因组成熟tRNA谱检测方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5phos/TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGATGrGrN，SEQIDNO.1；5phos表示5’端起始碱基有磷酸基团修饰，TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGAT为脱氧核糖核酸序列，GrGr为核糖核酸序列，N为任意碱基。用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，包括如SEQIDNO.2～115所示的57对引物，见表1。表1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，包括上述接头和引物组。一种人类基因组成熟tRNA谱检测方法，具体步骤如下：(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与上述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为上述引物组中的下游引物混合物；(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；(5)qPCR检测。优选的，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μlTE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。优选的，步骤(2)中，抽提总RNA与接头的配比为20ng：1pm。优选的，步骤(2)中，孵育的具体方法如下：(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。进一步优选的，步骤(2-1)中，退火溶液的组成如下：接头2μl(20pm)，总RNA400ng，无RNA酶水补充至9μl。更进一步优选的，步骤(2-2)中，加入1μl10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)。更进一步优选的，步骤(2-3)中，连接反应体系的组成如下：步骤(2-2)所得溶液10μl，连接酶缓冲液(NEB,M0239L)2μl，T4RNA连接酶(NEB,M0239L)0.1μl，无RNA酶水7.9μl。优选的，步骤(3)中，退火溶液的组成如下：步骤(2)所得混合液20μl，特异性下游引物混合物3.42μl，无RNA酶水0.58μl。优选的，步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。优选的，步骤(4)的具体方法：加入共反转录反应液，按照说明书提供的步骤操作，37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。进一步优选的，加入6μl5×PrimeScriptRTMasterMix共反转录反应液。优选的，步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTMGreenPCRMasterMix5μl，cDNA2μl，上游引物混合物(10pm)0.25μl，下游引物混合物(10pm)0.25μl，双蒸水2.5μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。上述接头、引物组或试剂盒在人类基因组成熟tRNA谱检测中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的特点，将根据GtRNA2.0公布的人类基因组tRNA基因序列设计用于荧光定量的PCR引物和新型接头，经反复试验，优化qPCR反应体系和反应参数，建立了检测人类基因组成熟tRNA谱的试剂盒及方法。本专利技术简化了RNA提取和去氨基酸步骤，设计了新型接头用于成熟tRNA的连接，创新性的提出了tRNA和mRNA共反转录方法。本专利技术克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本专利技术的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为本专利技术的试验原理图；图2为戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例：qPCR检测人类肝癌细胞系戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析1.试验材料人肝癌细胞系(Huh7.0)(JCRBNo.：JCRB0403)，Huh7.0-HEV细胞模型和Huh7.0-HEV-luc细胞模型是将HEV基因组全长RNA或HEV-lucRNA转染Huh7.0后获得，参考文献(Shukla,P.,etal.(2012)."Adaptationofagenotype3hepatitisEvirustoefficientgrowthincellculturedependsonaninsertedhumangenesegmentacquiredbyrecombination."JVirol86(10):5697-5707.)制备，RNA抽提:NucleoSpin@RNA(MACHEREY-NAGEL,740955.250)，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM,PH8.0)，T4RNA连接酶(dsR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，其特征在于，包括如SEQIDNO.2～115所示的57对引物。3.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的接头和权利要求2所述的引物组。4.一种人类基因组成熟tRNA谱检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与权利要求1所述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为权利要求2所述引物组中的下游引物混合物；(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；(5)qPCR检测。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μlTE缓冲液洗脱，即可在总R...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧旭敏，潘秋卫，程安春，汪铭书，朱德康，
申请(专利权)人：四川农业大学，西北民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51