一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4‑哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。采用本发明专利技术的鲍鱼血细胞抗凝保护剂可保证鲍鱼血细胞在较长时间内不发生凝集且维持较高的存活率，解决了鲍鱼血细胞离体后短时间内凝集成团的问题，为研究鲍鱼非特异性免疫能力奠定基础。

Abalone blood cell anticoagulant protective agent and preparation method thereof

The present invention discloses a anticoagulant protective agent for abalone blood cells and the preparation method. The anticoagulant protector consists of the following components: sodium chloride 2.45 ~ 2.55g, EDTA0.9 to 1.1g, 1, 4, 0.22 ~ 0.24g and 0.1mM PBS 100ml. The anticoagulant protective agent of abalone blood cells can ensure that abalone blood cells do not agglutinate for a long time and maintain a high survival rate, which solves the problem of agglutination in a short time after the abalone blood cells in vitro, which lays the foundation for studying the non specific immunity of abalone.

【技术实现步骤摘要】
一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法
本专利技术涉及血细胞抗凝保护剂
，具体涉及一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法。
技术介绍
鲍鱼由于营养丰富，经济价值高，成为我国重要的海水养殖品种。近年来，鲍鱼养殖遭受病害困扰，产量受到显著影响。针对鲍鱼非特异性免疫能力的研究成为解决鲍鱼病害问题的关键要素之一。鲍鱼主要通过血细胞对病原微生物的吞噬作用来实现基本的防御功能，因此对鲍血细胞的研究是探索非特异性免疫的重要环节。在不加抗凝保护剂的情况下，鲍鱼血细胞一旦离体，几分钟内即大量凝集。即便加入某些抗凝保护剂的鲍鱼血细胞在短时间内也会大量死亡，这个特点严重阻碍了我们对鲍鱼血细胞进行生化、免疫和分子生物学方面的研究。因此，开发在一定时间内可以防止鲍鱼血细胞凝集并保持细胞活性的抗凝保护剂是研究鲍鱼非特异性免疫能力的基础。目前应用于鲍鱼血细胞的抗凝保护剂有灭菌海水、磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris盐缓冲液(TBS)、哺乳动物血细胞的抗凝保护剂和其他贝类(牡蛎和扇贝)血细胞的抗凝保护剂等。应用效果上，灭菌海水、PBS和TBS并不适合，鲍鱼血细胞在短时间内就会发生大量凝集，并且血细胞的吞噬活性显著受到抑制。应用改良的哺乳动物血细胞保存液(modifiedAlserver’ssolution，MAS)，即MAS抗凝保护剂，可以短暂保存疣鲍和牡蛎血细胞，但其抗凝效果并不清楚。应用牡蛎和扇贝抗凝保护剂可以得到不错的抗凝效果，但是抗凝时间不能持续很久。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，用以解决现有技术中鲍鱼血细胞离体后短时间内大量凝集的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mMPBS100ml。优选地，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、EDTA1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mMPBS100ml。本专利技术还公开了上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法，具体包括如下步骤：(1)取0.1mMPBS缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入固体氯化钠粉末搅拌3-5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；(2)然后将混合溶液A放入38-40℃水浴锅中加热，再缓慢加入EDTA，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；(3)将混合溶液B转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌0.5-1h，使各组分充分溶解到PBS缓冲液中；(4)超净工作台开启紫外杀菌功能30-35min，然后在超净工作台上将混合溶液B先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂(记为AP)。优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(2)中水浴锅加热温度为40℃。优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(3)中磁力搅拌器搅拌时间为0.5h。上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂可在4℃或室温条件下，保存于灭菌蓝盖瓶中备用。本专利技术方法具有如下优点：所制得的鲍鱼血细胞抗凝保护剂可在4℃保存，采用本专利技术的鲍鱼血细胞抗凝保护剂可保证鲍鱼血细胞在较长时间内维持较高的存活率。为研究鲍鱼非特异性免疫能力奠定基础。附图说明图1是鲍鱼血细胞离体1.5h后在各抗凝保护剂中的凝集情况(无抗凝保护剂组为对照组)；图2是鲍鱼血细胞离体3h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；图3是鲍鱼血细胞离体4h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；图4是鲍鱼血细胞离体5h后在各抗凝保护剂中的凝集情况；图中，箭头所指为细胞凝集现象。具体实施方式下面将通过具体实施例来对本专利技术进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本专利技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本专利技术的范围。本专利技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。实施例1一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.5g、EDTA1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mMPBS100ml。上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：(1)取100ml0.1mMPBS缓冲液放入烧杯中，再向烧杯中加入2.5g固体氯化钠粉末搅拌3分钟，直到氯化钠全部溶解，然后再加入0.23g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；(2)然后将混合溶液A放入40℃水浴锅中加热，再缓慢加入EDTA1g，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；(3)将混合溶液B转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌0.5h，使各组分充分溶解到PBS缓冲液中；(4)超净工作台开启紫外杀菌功能30min，然后在超净工作台上将混合溶液B先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。实施例2一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.55g、EDTA1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.24g和0.1mMPBS100ml。上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：(1)取100ml0.1mMPBS缓冲液放入烧杯中，再向烧杯中加入2.55g固体氯化钠粉末搅拌4分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入0.24g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；(2)然后将混合溶液A放入39℃水浴锅中加热，再缓慢加入1.1gEDTA，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；(3)将混合溶液B转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌45min，使各组分充分溶解到PBS缓冲液中；(4)超净工作台开启紫外杀菌功能32min，然后在超净工作台上将混合溶液B先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。实施例3一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.45g、EDTA0.9g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22g和0.1mMPBS100ml。上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法具体为：(1)取100ml0.1mMPBS缓冲液放入烧杯中，再向烧杯中加入2.45g固体氯化钠粉末搅拌5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入0.22g1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；(2)将混合溶液A放入38℃水浴锅中加热，再缓慢加入0.9gEDTA，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；(3)将混合溶液B转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌1h，使各组分充分溶解到PBS缓冲液中；(4)超净工作台开启紫外杀菌功能35min，然后在超净工作台上将混合溶液B先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂。为了进一步证明本专利技术的有益效果，申请人还进行了如下试验：一、不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，其特征在于，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA 0.9～1.1g、1，4‑哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。

【技术特征摘要】
1.一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，其特征在于，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mMPBS100ml。2.根据权利要求1所述的鲍鱼血细胞抗凝保护剂，其特征在于，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、EDTA1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mMPBS100ml。3.一种如权利要求1或2所述的鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)将0.1mMPBS缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入固体氯化钠粉末搅拌3-5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后再加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解后得混合溶液A...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明珠，孔瑶瑶，杨熙芸，姚传伟，李浩宇，孟晓雪，刘明芳，阮泽立，李圣强，毕秀娟，时心泽，潘世杰，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37