涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法技术

本发明专利技术的目的在于提供有效率的向血细胞进行分化的方法。具体而言，本发明专利技术通过在体外由ES细胞或iPS细胞等多能干细胞制备血细胞时在低氧分压下进行培养，使向造血祖细胞或红系祖细胞等分化的效率增大，使最终得到的所需血细胞的数目增大。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201180034111.9、申请日为2011年9月9日、专利技术名称为“涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法”的专利技术申请的分案申请。
本专利技术涉及用于向血细胞分化的细胞培养方法。更具体而言，本专利技术涉及使能够向造血祖细胞进行分化的细胞分化成造血祖细胞、进而分化成血细胞的细胞培养法。
技术介绍
在治疗血液相关疾病时，稳定地供给各种血细胞的必要量是非常重要的。迄今为止，主要由通过供体献血而采集的血液来制备各种血细胞，用于手术等的治疗。然而，由于慢性的供体不足，因此不容易在必要时迅速确保充分量的血细胞。特别是，血液凝固(止血)所必需的细胞即血小板虽然在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等中是必需的细胞，但是无法将从供体采集到的血小板进行冷冻保存，因此对用于稳定供给的有效方法的需求是极其高的。最近，也在积极进行在不依赖于来自供体的提供的情况下由ES细胞、iPS细胞等多能干细胞在生物体外制备各血细胞的尝试，其实用化备受重视。例如，Takayama等报告了成功地从人ES细胞产生血小板的情况(专利文献1及非专利文献1)。此外，还公开了同样地也可从iPS细胞制备血小板的情况(专利文献2)。通过开发出在生物体外由多能干细胞制备血细胞的方法，从而今后的医疗现场中使用的各种血细胞中的大多数可由多能干细胞制备，从而产生对容易地解决慢性血细胞不足的期待。然而，迄今为止所报告的由iPS细胞或ES细胞制备血细胞的方法中，现状是制得的血细胞的量少而难以确保手术等治疗所认为必要的量。因此，应当利用某种方法促进向血细胞的分化，因此，有必要对现有方法进行改良。作为在进行细胞分化诱导时生物体内与生物体外存在很大不同的条件之一，可举出氧浓度。已报告了在生物体外进行细胞分化诱导时在比大气氧环境低的氧浓度下将各祖细胞进行培养等而进行分化诱导的几个例子(非专利文献2～非专利文献5，专利文献3～专利文献5)。例如，迄今为止，报告了将能够分化成软骨的细胞在低氧条件下进行培养而进行软骨分化的方法(专利文献3)、将未分化中枢神经细胞(专利文献4)或神经嵴干细胞(专利文献5)在低氧条件下进行培养的方法、将ES细胞在低氧浓度下培养后在大气氧浓度下培养而使之向心肌细胞分化的方法(非专利文献5)等。然而，对于低氧浓度对向血细胞进行分化的影响，尚未存在被详细报告的前例。现有技术文献专利文献专利文献1:WO2008/041370专利文献2:WO2009/122747专利文献3:日本特开2003-125787专利文献4:WO00/29550专利文献5:WO00/29549非专利文献非专利文献1:Takayama等，Blood，111:5298-5306 2008非专利文献2:Kennedy等，Blood，109:2679-2687 2007非专利文献3:Prado-Lopez等，Stem Cells，28:407-418 2010非专利文献4:Martin-Rendon等，Stem Cells，25:1003-1012 2010非专利文献5:Bauwens等，Biotechnol Bioeng.，90:452-461 2005
技术实现思路
本专利技术人等已经确立了由多能干细胞取得造血祖细胞、进而使之分化成各种血细胞的方法，但是利用该方法制得的血细胞的量少，处于作为用于治疗等的量不能说是充分的状况。因此，本专利技术鉴于上述情况，以确立更大量且稳定地在体外制备血细胞的方法为目标，目的在于提供向造血祖细胞进行分化诱导的新型方法，以及提供由该方法制得的造血祖细胞及从该造血祖细胞分化诱导的各种血细胞。专利技术人等在由多能干细胞诱导造血祖细胞的工序中，在一定期间在低氧分压下进行细胞培养，结果发现经诱导的造血祖细胞的数目比仅在大气氧分压下进行培养时增大，从而完成本专利技术。即，本专利技术涉及以下(1)～(16)。(1)一种造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，包括以下工序:将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境中进行细胞培养。(2)根据上述(1)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述氧分压上升的环境是包括在低氧分压下进行细胞培养的工序的环境。(3)根据上述(2)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述低氧分压为0.1～10％。(4)根据上述(2)或(3)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述低氧分压是如下的氧分压:在该分压下进行培养时，与在其它分压下的培养相比，低氧应答性的基因表达。(5)根据上述(2)～(4)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，在所述低氧分压下由细胞培养开始进行一定期间的细胞培养后，在更高的氧分压下进一步进行细胞培养。(6)根据上述(5)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间为4～10天。(7)根据上述(5)或(6)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间是到呈现KDR阳性、CD34阳性、CD43阳性的细胞出现为止。(8)根据上述(5)～(7)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，改变至所述更高的氧分压下的时期是成为中内胚层诱导的指标的基因表达的时期、成为造血祖细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期、成为分化增殖性细胞因子的指标的基因的表达开始的时期、或者成为血细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期。(9)根据上述(5)～(8)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述更高的氧分压为11～30％的氧分压。(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，能够向所述造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞为多能干细胞。(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述造血祖细胞或红系祖细胞是从网状结构或拟胚体取得的。(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，在进行所述细胞培养的培养基中不添加VEGF。(13)一种造血祖细胞或红系祖细胞，是由上述(1)～(12)中任一项所述的方法制得的。(14)一种血细胞，是将上述(13)所述的造血祖细胞或红系祖细胞进一步培养而制得的。(15)一种医药制剂，包含上述(14)所述的血细胞。(16)一种筛选促进或阻碍向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的物质的方法，其特征在于，使用上述(1)所述的制备方法。根据本专利技术，与现有方法相比，可使被分化诱导的造血祖细胞、红系祖细胞以及血细胞的数目增大。根据本专利技术，可缩短用于取得所需数目的造血祖细胞、红系祖细胞或血细胞的培养期间。根据本专利技术，可在不使用以往为了有效率地诱导造血祖细胞而必需的VEGF的情况下制备造血祖细胞。根据本专利技术，可获得血液分化能力高的造血祖细胞、红系祖细胞。附图说明图1为低氧分压下的培养赋予血细胞分化的效果。纵轴为在培养后产生的血细胞数。(1)为在21％氧分压下培养14天的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(3)为在5％氧分压下培养14天的结果。(1)、(2)及(3)的全部实验是在存在20ng/ml的VEGF的条件下进行的。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-4株)。图2表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，包括以下工序:将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境中进行细胞培养。

【技术特征摘要】
2010.09.10 JP 2010-2027521.一种造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，包括以下工序:将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境中进行细胞培养。2.根据权利要求1所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述氧分压上升的环境是包括在低氧分压下进行细胞培养的工序的环境。3.根据权利要求2所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述低氧分压为0.1～10％。4.根据权利要求2或3所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述低氧分压是如下的氧分压:在该分压下进行培养时，与在其它分压下的培养相比，低氧应答性的基因表达。5.根据权利要求2～4中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，在所述低氧分压下从细胞培养开始进行一定期间的细胞培养后，在更高的氧分压下进一步进行细胞培养。6.根据权利要求5所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间为4～10天。7.根据权利要求5或6所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间是到呈现KDR阳性、CD34阳性、CD43阳性的细胞出现为止。8.根据权利要求5～7中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐野进弥，江藤浩之，高山直也，中内启光，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，泰尔茂株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP