两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用制造技术

本发明专利技术提供了两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，来源于杨梅果实的双加氧酶家族，其氨基酸序列SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示。在杨梅果实发育过程中，MrFLS1基因表达与黄酮醇累积呈正相关关系，MrFLS2则在果实成熟时高表达，与后期黄酮醇含量增加相关。本发明专利技术验证了MrFLS1和MrFLS2基因的功能，原核表达体外验证表明，MrFLS1和MrFLS2蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素，且MrFLS2具有较高催化效率；在烟草中过量表达MrFLS1或MrFLS2，转基因植株的黄酮醇含量均显著增加。本发明专利技术可在工程微生物菌及植物遗传转化中的应用。

Application of two myricetin synthetase MrFLSs protein and its coding genes

The present invention provides two Myrica flavanone synthetase MrFLSs protein, which is derived from the double oxygenase family of the fruit of Myrica Myrica and its amino acid sequence SEQ:NO.18 and SEQ:NO.19. During the fruit development of bayberry, the expression of MrFLS1 gene was positively correlated with the accumulation of flavonol, while MrFLS2 was highly expressed in the fruit ripening, which was related to the increase of flavonol content in the later period. The present invention verifies the functions of MrFLS1 and MrFLS2 genes. The prokaryotic expression in vitro shows that MrFLS1 and MrFLS2 proteins can catalyze the formation of two hydro - ananenol, catalyze the formation of quercetin with two hydrogen quercetin, and MrFLS2 has high catalytic efficiency; the excessive expression of MrFLS1 or MrFLS2 in tobacco and the flavonoid of transgenic plants in tobacco The content of alcohol increased significantly. The invention can be applied to engineering microbes and plant genetic transformation.

【技术实现步骤摘要】
两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及重组蛋白和基因工程，具体涉及两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白及其编码基因的应用。技术背景FLS(EC1.14.11.23)属于FeⅡ/2-酮戊二酸盐依赖性双加氧酶家族，是合成黄酮醇化合物必不可少的关键酶之一，在2-酮戊二酸盐和氧气存在的条件下，它催化二氢黄酮醇发生去饱和反应，生成黄酮醇、琥珀酸盐、二氧化碳和水。黄酮醇广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中，对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线、调节叶片气孔开度等。FLS基因在转录水平上的表达模式与植物黄酮醇的积累密切相关。拟南芥种子萌发过程中，白光照射能引起AtFLS1在不同组织中的差异性表达，并导致黄酮醇不同程度的积累。反义NtFLS后，烟草中无法检测到黄酮醇，而花粉也不能正常萌发成花粉管。杨梅(Morellarubra)属于我国特色水果，具有很好的医药学活性，这与其较高的黄酮类化合物含量密不可分，而黄酮醇是杨梅中主要的黄酮类化合物，通常以糖苷衍生物形式存在于液泡中。大量研究报道了黄酮醇抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性。富含黄酮醇的植物可用于生产保健食品、药品，具有广阔的开发应用前景。鉴别出参与杨梅果实黄酮醇生物合成相关的FLS，对于阐明杨梅果实黄酮醇生物合成机制具有重要意义，为开发工程微生物菌奠定基础，且可指导研究单一黄酮醇化合物分流机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，来源于杨梅果实的双加氧酶家族，是两个参与杨梅黄酮醇生物合成的关键基因MrFLS1和MrFLS2，其氨基酸序列如SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示，其编码的核苷酸序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示。本专利技术的另一个目的是提供所述的两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白在工程微生物菌及植物遗传转化中的应用。利用原核表达技术将pET28a-MrFLS1或pET28a-MrFLS2重组质粒转化BL21(DE3)，诱导出的蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素；利用基因工程技术获得高表达MrFLS1或MrFLS2的烟草转基因植株，相较于野生型，转基因株系中黄酮醇含量显著增加。本专利技术提供的基因特征如下：(1)基因表达特征：随着杨梅果实发育，MrFLS1表达先降后升，与杨梅黄酮醇的变化趋势一致，MrFLS2则在杨梅果实成熟时高表达，与后期黄酮醇含量增加相关；(2)基因功能特征：(1)大肠杆菌BL21(DE3)表达PET28a-MrFLS1或PET28a-MrFLS2重组载体，诱导表达出的蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素，说明MrFLSs编码的蛋白具有黄酮醇合成酶活性，能够将二氢黄酮醇转化为黄酮醇；(3)利用基因工程技术获得过表达MrFLS1或MrFLS2的转基因烟草植株，与野生型相比，转基因株系花中黄酮醇含量显著上升。本专利技术提供了两个参与杨梅黄酮醇生物合成的关键基因MrFLS1和MrFLS2，从杨梅果实中分离获得，分别具有如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示的核苷酸序列，SEQ:NO.18和SEQ:NO.19所示的氨基酸序列。杨梅果实发育过程中，MrFLS1基因表达与黄酮醇累积呈正相关关系，MrFLS2则在杨梅果实成熟时高表达，与后期黄酮醇含量增加相关。本专利技术验证了MrFLS1和MrFLS2基因的功能，原核表达体外验证表明，MrFLS1和MrFLS2蛋白均可将二氢山奈酚催化生成山奈酚、将二氢槲皮素催化生成槲皮素，且MrFLS2具有较高催化效率；在烟草中过量表达MrFLS1或MrFLS2，转基因植株的黄酮醇含量均显著增加；本工作对研究单一黄酮醇化合物分流机制具有指导意义，为开发工程微生物菌奠定基础。附图说明图1.杨梅发育过程中黄酮醇含量变化。图2.杨梅发育阶段MrFLS1或MrFLS2基因表达模式。图3.原核表达MrFLS1或MrFLS2重组蛋白SDS-PAGE图。图4.重组蛋白活性显示MrFLS1能够将二氢山柰酚转化为山柰酚。图5.重组蛋白活性显示MrFLS1能够将二氢槲皮素转化为槲皮素。图6.重组蛋白活性显示MrFLS2能够将二氢山柰酚转化为山柰酚。图7.重组蛋白活性显示MrFLS2能够将二氢槲皮素转化为槲皮素。图8.过量表达MrFLS1或MrFLS2显著改变烟草黄酮醇含量。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。说明：本专利技术中涉及的目的基因引物设计、全长克隆、表达载体构建、RNA提取、cDNA合成、测序分析和鉴定以及PCR产物的分离纯化等基本操作，可按照本领域已知的技术进行，若未特别说明，实施例中的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。实施例1：MrFLSs基因全长获得及鉴定在荸荠杨梅果实的RNA-Seq数据库中，以flavonol为关键词搜索与黄酮醇合成相关的基因，并以拟南芥中功能明确的AtFLS1氨基酸序列为参考，通过CLUSTALX软件同源比对，筛选出两个可能参与杨梅果实黄酮醇合成的基因Unigene19653(MrFLS1)和Unigene16520(MrFLS2)，应用序列分别为：SEQ:NO.1和SEQ:NO.2，并通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析，确认其为全长序列。设计全长克隆引物：SEQ:NO.3和SEQ:NO.4及SEQ:NO.5和SEQ:NO.6，PCR反应体系为50μL，成分分别为：0.5μLRoche高保真酶，5μL缓冲液(10×)，4μLdNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，HuaGene)各2μL，4μLcDNA，32.5μLH2O。反应程序为：预变性95℃，2min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，90min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。克隆结果经测序验证，获得与转录组数据库相匹配的MrFLSs全长序列SEQ:NO.1和SEQ:NO.2。在线翻译成氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)，即：SEQ:NO.18(MrFLS1)和SEQ:NO.19(MrFLS2)。实施例2：杨梅发育阶段果实MrFLSs基因表达和黄酮醇含量检测1.杨梅果实材料荸荠杨梅发育阶段果实当天采收，经液氮冷冻后存放于-80℃冰箱，每个阶段果实组织设置3个生物学重复，每个重复6-7个果实。2.RNA提取和cDNA合成杨梅组织样品在液氮环境中研磨成粉末，利用普通CTAB法提取总RNA，经电泳检测合格后，参照TURBODNAaseKit(Ambion)说明书，去除DNA，根据iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad)要求，取1.0μgRNA，反转录成cDNA。4.黄酮醇含量检测分别称量0.3g左右鲜样粉末，按1:10(g：mL)溶于80％甲醇(1％HCL)中，浸泡2h，超声30min，重复3次，合并上清液，得粗提液6mL。取1mL提取液30℃旋转真空浓缩到只剩水相，10000rpm离心5min，定容到200μL色谱甲醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ:NO.18和SEQ:NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ:NO.18和SEQ:NO.9所示。2.根据权利要求1所述的两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白，其特征在于，所述蛋白编码的核苷酸序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示。3.根据权利要求1所述的两个杨梅黄酮醇合成酶MrFLSs蛋白在工程微生物菌及植物遗传转化中的应用。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鲜，邢梦云，曹运琳，任传宏，解林峰，徐昌杰，孙崇德，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33