一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种评估冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包括：用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂、以及说明书。本发明专利技术的试剂盒能够高效、准确用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价，且灵敏度和特异性较好，能够满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求。

A kit for assessing coronary artery disease

The present invention provides a kit for assessing coronary artery disease. The kit includes: detection reagents for detecting the concentration of Cer (d18:1/16:0), Cer (d18:1/18:0), Cer (d18:1/24:0) and Cer (d18:1/24:1) in samples of subject subjects, and instructions. The kit can be used efficiently and accurately for the diagnosis of coronary artery disease, risk stratification, monitoring and evaluation of the disease, and it has good sensitivity and specificity, and can meet the needs of the clinical diagnosis and treatment of coronary artery disease.

【技术实现步骤摘要】
一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒
本专利技术涉及一种试剂盒，特别涉及一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒。
技术介绍
心血管病已成为全球人类死亡率最高的疾病，心血管病的每年死亡率已超过其他疾病，成为第一位的死亡病因。2015年，约有1.77亿人由于心血管病死亡，占全球死亡人数的31％，其中有7400万人死于冠状动脉疾病。随着我国经济水平的发展，人民生活水平的提高，饮食结构的改变及人口迅速老龄化，心血管病的发病率和死亡率呈上升趋势。2016年“中国心血管病报告”指出我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。推算我国心血管疾病患病人数为2.9亿，其中冠心病为1100万。在中国，心血管病死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民因疾病死亡构成的40％以上。鉴于冠状动脉疾病的高发病率和高死亡率，预防冠状动脉患者的致命性和非致命性心肌梗死，仍然是临床上的挑战。每年稳定性冠状动脉患者的死亡率在1-3％之间，非致命性发病率在1-2％之间。在急性病症存活的急性冠状动脉综合征患者中，心肌梗死的死亡率明显升高(尤其在第一年内)。然而发病风险在各个病人中非常不同，这就需要有效的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的工具来提高病人的识别和管理。冠状动脉疾病标志物是动脉粥样硬化发生发展过程中增加或减少的生物活性物质，可用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价。它会对冠状动脉疾病的临床治疗带来巨大的影响，因此为了满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求，高效、准确的标志物的研发亟待加速。目前用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能为临床医生提供更多的参考价值。例如，血清中的总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与动脉粥样硬化相关联，其被长期用来进行心血管疾病的诊断、危险分层和预后。但是，这些传统的危险分子的测定不能识别出很大一部分具有高风险心血管疾病的病人。因此，除了低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)这些传统的危险分子，急需寻找一种更准确的、更具预测性的危险因子。游离脂质组学分析显示一些脂质可能作为冠状动脉疾病的有效诊断、危险分层和预后的标志物。脂质组学研究发现在冠状动脉疾病患者中特定的神经酰胺种类与心血管死亡显著相关(Meikle,P.J.etal.Plasmalipidomicanalysisofstableandunstablecoronaryarterydisease.ArteriosclerThrombVascBiol31,2723-2732,doi:10.1161/ATVBAHA.111.234096(2011).)。神经酰胺是由鞘氨醇和脂肪酸组成。神经酰胺主要通过鞘磷脂酶通路产生，鞘磷脂酶分解鞘细胞膜上的磷脂并释放神经酰胺。同时神经酰胺可以通过新合成通路由六种脂酰选择性神经酰胺合成酶利用简单分子合成。不同的神经酰胺类分子具有特定的生理功能。几个关键的细胞因子(如肿瘤坏死因子和白介素)可以诱导炎性反应(如动脉粥样硬化和缺血再灌流损伤)，而神经酰胺水平在这些炎性反应中升高。一些心血管危险因子和标志物(如氧化的低密度脂蛋白和同型半胱氨酸)可以增加神经酰胺的产生。另外，神经酰胺作为信号分子参与调控许多细胞反应和功能，包括分化、增值、细胞凋亡、活性氧产生和基因表达，这些作用直接参与心血管疾病的分子机制。神经酰胺目前也是治疗冠状动脉疾病药物开发的一个重要靶点。研究证明，鞘磷脂的代谢过程是一个动态的过程，鞘磷脂的代谢物(包括神经酰胺、鞘氨醇)作为第二信使在冠状动脉疾病中起到重要作用(Kolesnick,R.Thetherapeuticpotentialofmodulatingtheceramide/sphingomyelinpathway.JClinInvest110,3-8,doi:10.1172/JCI16127(2002).)。当把神经酰胺类似物直接作用于受损的动脉时，可以表现出强烈的抗恶性细胞增生扩散的作用(Bourbon,N.A.,Yun,J.,Berkey,D.,Wang,Y.&Kester,M.InhibitoryactionsofceramideuponPKC-epsilon/ERKinteractions.AmJPhysiolCellPhysiol280,C1403-1411(2001).)。血管平滑肌细胞的新内膜增生和冠状动脉的二次阻塞是气囊血管成形术和动脉支架植入术后发生再狭窄的原因，影响全球300万接受冠状动脉血管成形术的患者。神经酰胺可以抑制由ERK激酶和AKT激酶级联反应诱导的血管平滑肌的增生。C6神经酰胺包被的气囊导管可以阻止拉伸诱导的血管平滑肌细胞的新内膜增生(Charles,R.etal.Ceramide-coatedballooncatheterslimitneointimalhyperplasiaafterstretchinjuryincarotidarteries.CircRes87,282-288(2000).)。已有大量的分析方法来测量神经酰胺，包括薄层色谱法、常液相色谱法、免疫化学方法、气相色谱法和串联质谱法。然而，大部分的方法都是为研究工作而非临床使用而设计的，这些方法的共同缺点是它们在分子种类水平上无法对神经酰胺进行分析，并缺乏选择性、通量低、精确度和准确性低，因此不能满足临床实验室的要求。我们同样不能利用传统的免疫实验方法来区分这四种神经酰胺，因为每种神经酰胺的抗原表位都太相似了。抗神经酰胺抗体识别一类神经酰胺分子，它们只在脂肪酸链长度上有所不同。因此，现有抗体的低选择性阻碍了临床有效免疫测定方法的发展(Krishnamurthy,K.,Dasgupta,S.&Bieberich,E.Developmentandcharacterizationofanovelanti-ceramideantibody.JLipidRes48,968-975,doi:10.1194/jlr.D600043-JLR200(2007).)。而LC-MS/MS的主要优点在于结合色谱分离与质谱的精确监测，可以明确检测每种神经酰胺分子(Kauhanen,D.etal.Developmentandvalidationofahigh-throughputLC-MS/MSassayforroutinemeasurementofmolecularceramides.AnalBioanalChem408,3475-3483,doi:10.1007/s00216-016-9425-z(2016).)。
技术实现思路
本专利技术基于神经酰胺类物质与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关，并与心血管死亡显著相关的发现，将血浆心血管死亡风险相关的神经酰胺分子(Cer(d18:1/16:0)，Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1))及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测、疗效评价及候选药物疗效评价。本专利技术的目的之一在于提供用于确定来自受试对象的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。2.用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度分别与Cer(d18:1/24:0)的浓度的比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，确定所述来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度的方法为蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；优选地，所述样品为血液、血浆或血清。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述冠状动脉疾病标志物还包括非神经酰胺类化合物，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白颗粒数目、致密的低密度脂蛋白、载脂蛋白B、脂蛋白a、脂蛋白磷脂酶A2、高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白颗粒数目、致密的高密度脂蛋白、载脂蛋白A1、C反应蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌红蛋白中的一种或多种。5.一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)浓度的检测试剂、以及说明书；针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述说明书中包括：健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果确定可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或者具有罹患冠状动脉疾病的风险的方法，其中所述方法具体如下：将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；在判断受试对象是否患有冠状动脉疾病时，当所述六项检测指标的总得分等于或大于7分时，判断受试对象患有冠状动脉疾病；在判断受试对象罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述说明书中包括：标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/18:0)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值的50％分位值和75％分位值，以及利用受试对象的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:0)和Cer(d18:1/24:1)的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的方法，其中所述方法具体如下：将所述正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)的浓度，以及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度分别与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值六项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，所述标准人群样本由健康人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的50％；当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述六项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述六项检测指标的总得分范围为0-12分；在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述六项检测指标的总得分为0-2分时，判断为低风险；当所述六项检测指标的总得分为3-6分时，判断为中等风险；当所述六项检测指标的总得分为7-9分时，判断为较高风险；当所述六项检测指标的总得分为10-12分时，判断为高风险；在对所述受试对象进行病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价时，对比所述受试对象在治疗前和治疗后的所述六项检测指标的总得分；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分大于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较差，或判定所述候选治疗药物疗效较差；当治疗后所述受试对象的六项检测指标的总得分小于治疗前所述受试对象的六项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较好，或...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗琳，崔雅轩，崔文宏，张丽丽，郝敬雨，姜平，
申请(专利权)人：北京豪思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11