一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用。所述血浆蛋白分离物包括：α、β球蛋白，铜蓝蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白以及白蛋白；所述血浆蛋白分离物的制备方法依次包括：从血液中分离血浆，对血浆进行冷沉淀去除，对所述冷沉淀去除得到的上清液进行四次低温乙醇沉淀，取第四次低温乙醇沉淀后得到的沉淀物作为所述血浆蛋白分离物。本发明专利技术经过一系列合理的操作步骤，各个步骤中选用合理的试剂和参数，各种因素相互协调作用，提高了该血浆蛋白分离物对于阿尔茨海默症的疗效和增强记忆力的功效。本发明专利技术的制备方法简单，可以直接工业化放大生产，大规模地应用于制药工业。

A plasma protein isolate for Alzheimer's disease and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种血浆蛋白分离物，具体地，涉及一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease,AD)又称早老性痴呆，是一种由神经元丢失导致的脑中枢神经系统退行性疾病，在老年人群中该病的发病率约为4％-8％。1906年，德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性记忆力下降表现的51岁女性患者。1910年，以命名和分类大脑疾病著称的精神病学家EmilKraepelin提议将此病命名为阿尔茨海默症。该病常见的临床表现为进行性记忆力和认知力减退、语言障碍、精神运动异常等，对患者的正常生活造成严重影响，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。随着人口老龄化时代的到来，阿尔茨海默症成为危害公共健康的主要疾病之一，全球几乎3.5亿人口受到其影响。AD是一种最为常见的神经退行性病变，其主要病理特征是淀粉样斑块(即老年斑，senileplaque，SP)沉积、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)和神经元丢失。由于AD的病因和发病机制尚不明确，目前临床上尚没有药物能够逆转或阻止病情发展。在衰老研究领域，有很多科学家通过异体共生方式将年轻小鼠与年迈小鼠的循环系统连接在一起。在心脏、大脑、肌肉、肝脏与骨骼组织中，年轻血液似乎能逆转衰老带来的影响，使年迈小鼠变得更加强壮、聪明和健康，因此认为在年轻人血液中存在能够逆转衰老的因子。随之而来，多种抗衰老因子被鉴定出来，如催产素；生长分化因子-11；TIMP-2等。血浆是血液的液体成分，其组成及其复杂，包括蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、代谢废物以及大量的水。血液制品是从人血浆中分离制备的有明确临床应用意义的血浆蛋白制品的总称。美国哈佛大学E.J.Cohn教授及其同事们于1946年创建了低温乙醇法人血浆蛋白分离技术(被称为Cohn6法)，并用该工艺分离制备出第一种血浆制品，即人血浆白蛋白。随后于1949年Cohn又发表了用于分离制备丙种球蛋白的Cohn9法。Cohn6+9法，即低温乙醇分离法，形成了工业化人血浆蛋白分离的完整系统。但是，目前专门针对于阿尔茨海默症的血浆蛋白提取物的低温乙醇分离方法、和得到的血浆蛋白分离物还尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物，所述血浆蛋白分离物包括：α、β球蛋白，铜蓝蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白以及白蛋白，所述血浆蛋白分离物的制备方法依次包括：从血液中分离血浆步骤，对血浆进行冷沉淀去除步骤，对所述冷沉淀去除步骤得到的上清液进行第一次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第一次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第二次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第二次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第三次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第三次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第四次低温乙醇沉淀的步骤，取所述第四次低温乙醇沉淀后得到的沉淀物作为所述血浆蛋白分离物。作为优选的实施方式，所述制备方法还包括：亲和层析法去除所述血浆蛋白分离物中IgM的步骤和除菌步骤；优选地，所述亲和层析法去除所述血浆蛋白分离物中IgM步骤中，亲和层析处理采用的亲和层析预装柱的填料优选为2-巯基吡啶连接琼脂糖；更优选地，所述亲和层析处理的步骤包括：利用1-10倍，优选为5倍柱体积的结合液平衡层析柱；再将所述血浆蛋白分离物上样；再利用10-20倍，优选为15倍柱体积的结合液洗出蛋白组分并检测，得到去除IgM的所述血浆蛋白分离物；优选地，所述除菌步骤中，将所述去除IgM的所述血浆蛋白分离物过滤除菌，得到无菌的所述血浆蛋白分离物；更优选地，所述过滤除菌的滤膜为0.22μm低蛋白吸附的PVDF膜，压力为不超过10bar，更优选为5bar；优选地，所述血浆蛋白分离物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括8条条带，所述条带的分子量为：9kD，16kD，40kD，25kD，50kD，57kD，70kD，132kD。作为优选的实施方式，所述分离血浆步骤中，收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；再将所述血浆冷冻为新鲜冷冻血浆；优选地，所述离心中，离心力为500-1200g，时间为10-30分钟，离心温度为0-8℃；更优选地，所述离心力为900g，时间为20分钟，离心温度为4℃；优选地，所述冷冻温度为小于等于零下30℃，更优选为零下40℃。作为优选的实施方式，所述冷沉淀去除步骤中，将所述新鲜冷冻血浆在2-6℃下融化后进行离心，其中上清液为抗凝血浆，沉淀物为冷沉淀；优选地，所述离心中，离心力为1000-5000g，时间为5-20分钟，离心温度为0-8℃；更优选地，所述离心力为3000g，时间为10分钟，离心温度为4℃。作为优选的实施方式，所述第一次低温乙醇沉淀步骤中，向所述冷沉淀去除步骤得到的上清液中加入乙醇溶液、pH调节剂，形成第一次低温乙醇沉淀体系，在所述第一次低温乙醇沉淀体系中，乙醇体积百分含量为5-10％，温度为0至-5℃，蛋白浓度为3-10g/dL，离子强度为0.10-0.20mol/kg，pH值为7.1-7.3；然后将该体系于0至-5℃条件下搅拌0.5-2h，随后进行分离处理，得到第一分离组分沉淀物和第一分离组分上清液；优选地，在所述第一次低温乙醇沉淀体系中，所述乙醇体积百分含量为8％，温度为-3℃，蛋白浓度为5.1g/dL，离子强度为0.14mol/kg，pH值为7.2；优选地，所述搅拌的温度为-3℃，时间为1h；第二次低温乙醇沉淀理步骤中，向所述第一分离组分上清液中加入乙醇溶液、pH调节剂，形成第二次低温乙醇沉淀体系，在所述第二次低温乙醇沉淀体系中，乙醇体积百分含量为22-28％，温度为0至-10℃，蛋白浓度为1-5g/dL，离子强度为0.05-0.20mol/kg，pH值为6.7-7.0；再将该体系于0至-10℃条件下搅拌3-8h，随后进行分离处理，得到第二分离组分沉淀物和第二分离组分上清液；优选地，在所述第二次低温乙醇沉淀体系中，所述乙醇体积百分含量为25％，温度为-5℃，离子强度为0.09mol/kg，蛋白浓度为3.0g/dL，pH值为6.9；优选地，所述搅拌的温度为-5℃，时间为5h；第三次低温乙醇沉淀步骤中，向所述第二分离组分上清液中加入乙醇溶液、pH调节剂，形成第三次低温乙醇沉淀体系，在所述第三次低温乙醇沉淀体系中，乙醇体积百分含量为15-20％，温度为0至-10℃，蛋白浓度为1.0-2.0g/dL，离子强度为0.05-0.20mol/kg，pH值为5.0-5.4；再将该体系于0至-10条件下搅拌0.5-2.0h，静置大于等于6h，随后进行分离处理，得到第三分离组分沉淀物和第三分离组分上清液；优选地，在所述第三次低温乙醇沉淀体系中，所述乙醇体积百分含量为18％，温度为-5℃，蛋白浓度为1.6g/dL，离子强度为0.09mol/kg，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物，其特征在于：所述血浆蛋白分离物包括：α、β球蛋白，铜蓝蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白以及白蛋白；/n所述血浆蛋白分离物的制备方法依次包括：从血液中分离血浆步骤，对血浆进行冷沉淀去除步骤，对所述冷沉淀去除步骤得到的上清液进行第一次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第一次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第二次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第二次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第三次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第三次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第四次低温乙醇沉淀的步骤，取所述第四次低温乙醇沉淀后得到的沉淀物作为所述血浆蛋白分离物。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物，其特征在于：所述血浆蛋白分离物包括：α、β球蛋白，铜蓝蛋白，运铁蛋白，结合珠蛋白以及白蛋白；
所述血浆蛋白分离物的制备方法依次包括：从血液中分离血浆步骤，对血浆进行冷沉淀去除步骤，对所述冷沉淀去除步骤得到的上清液进行第一次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第一次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第二次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第二次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第三次低温乙醇沉淀的步骤，对所述第三次低温乙醇沉淀步骤得到的上清液进行第四次低温乙醇沉淀的步骤，取所述第四次低温乙醇沉淀后得到的沉淀物作为所述血浆蛋白分离物。


2.根据权利要求1所述血浆蛋白分离物，其特征在于：
所述制备方法还包括：亲和层析法去除所述血浆蛋白分离物中IgM的步骤和除菌步骤；
优选地，所述亲和层析法去除所述血浆蛋白分离物中IgM步骤中，亲和层析处理采用的亲和层析预装柱的填料优选为2-巯基吡啶连接琼脂糖；
更优选地，所述亲和层析处理的步骤包括：
利用1-10倍，优选为5倍柱体积的结合液平衡层析柱；
再将所述血浆蛋白分离物上样；
再利用10-20倍，优选为15倍柱体积的结合液洗出蛋白组分并检测，得到去除IgM的所述血浆蛋白分离物；
优选地，所述除菌步骤中，将所述去除IgM的所述血浆蛋白分离物过滤除菌，得到无菌的所述血浆蛋白分离物；更优选地，所述过滤除菌的滤膜为0.22μm低蛋白吸附的PVDF膜，压力为不超过10bar，更优选为5bar；
优选地，所述血浆蛋白分离物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括8条条带，所述条带的分子量为：9kD，16kD，40kD，25kD，50kD，57kD，70kD，132kD。


3.根据权利要求1所述血浆蛋白分离物，其特征在于：所述分离血浆步骤中，收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；再将所述血浆冷冻为新鲜冷冻血浆；
优选地，所述离心中，离心力为500-1200g，时间为10-30分钟，离心温度为0-8℃；更优选地，所述离心力为900g，时间为20分钟，离心温度为4℃；
优选地，所述冷冻温度为小于等于零下30℃，更优选为零下40℃。


4.根据权利要求1所述血浆蛋白分离物，其特征在于：所述冷沉淀去除步骤中，将所述新鲜冷冻血浆在2-6℃下融化后进行离心，其中上清液为抗凝血浆，沉淀物为冷沉淀；
优选地，所述离心中，离心力为1000-5000g，时间为5-20分钟，离心温度为0-8℃；更优选地，所述离心力为3000g，时间为10分钟，离心温度为4℃。


5.根据权利要求1所述血浆蛋白分离物，其特征在于：所述第一次低温乙醇沉淀步骤中，向所述冷沉淀去除步骤得到的上清液中加入乙醇溶液、pH调节剂，形成第一次低温乙醇沉淀体系，在所述第一次低温乙醇沉淀体系中，乙醇体积百分含量为5-10％，温度为0至-5℃，蛋白浓度为3-10g/dL，离子强度为0.10-0.20mol/kg，pH值为7.1-7.3；然后将该体系于0至-5℃条件下搅拌0.5-2h，随后进行分离处理，得到第一分离组分沉淀物和第一分离组分上清液；
优选地，在所述第一次低温乙醇沉淀体系中，所述乙醇体积百分含量为8％，温度为-3℃，蛋白浓度为5.1g/dL，离子强度为0.14mol/kg，pH值为7.2；
优选地，所述搅拌的温度为-3℃，时间为1h；
第二次低温乙醇沉淀理步骤中，向所述第一分离组分上清液中加入乙醇溶液、pH调节剂，形成第二次低温乙醇沉淀体...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗琳，崔雅轩，江振作，陈玥，管书丽，石浩威，丁亮，
申请(专利权)人：北京豪思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11