一株解淀粉芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。采取的技术方案是：从种植芦笋的土壤中筛选分离出一株具有几丁质降解能力的解淀粉芽孢杆菌MY001,2017年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MY001.，保藏编号为：CGMCC NO.14460。该菌株可用于芦笋茎枯病防治，具体使用方法为：将浓度为1×10

Bacillus amyloid bacillus and its application

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a strain of Bacillus amylum and its application. The technical scheme is: screening and separating a Bacillus amylum with chitin degradation ability from the soil of Asparagus Planting, which is stored in the general microorganism center of the China microbe preservation management committee in July 26th MY0012017, the name of the strain: Bacillus amyloliquefaciens MY001., and preservation The number is: CGMCC NO.14460. The strain can be used for the control of asparagus stem blight. The specific method of use is: the concentration is 1 x 10.

【技术实现步骤摘要】
一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
芦笋茎枯病(Asparagusstemblight)又被称为芦笋的“癌症”，其发病症状主要集中于茎、侧枝或叶，具有发病快、易传染、损失严重的特点，一旦有芦笋感染，很容易大面积传播，导致整片芦笋植株突然变黄枯萎，不能有效产出芦笋产品。其主要致病病原菌为天门冬拟茎点霉(Phomopsisasparagi)。目前对芦笋茎枯病的防治，主要使用多菌灵、百菌清等化学农药，但长期使用该类化学农药，容易导致病菌产生抗药性，无法持续地对芦笋茎枯病进行有效防治。因此，开发有效的生物农药是防治芦笋茎枯病的可行方法。芽胞杆菌广泛分布于自然界,包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，这些菌株对外界有害因子抵抗力强。很多种芽孢杆菌具有抑制农作物病原菌繁殖生长的作用,是良好的生防细菌。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)属于革兰氏阳性菌，已经发现,解淀粉芽孢杆菌对植物病原菌具有广谱抑菌性，但其抑菌的有效性仍具有极强的特异性，针对不同的病原菌需要筛选出特异的生防菌株才能达到最佳抑菌效果。而将解淀粉芽孢杆菌应用于植物真菌病害防治的研究，大多集中在草莓、番茄、桃、土豆等作物上，特异性防治芦笋茎枯病的解淀粉芽孢杆菌尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌，2017年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为中国北京，菌种名称:解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamyloliquefaciens，MY001.，保藏编号为：CGMCCNO.14460。相应的，其16SrDNA测序序列如SEQIDNO1所示，其gyrA测序序列如SEQIDNO2所示，其gyrB测序序列如SEQIDNO3所示。相应的，所述解淀粉芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用。优选的，所述解淀粉芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用，所述真菌包括：天门冬拟茎点霉菌、拟盘多毛孢属菌、弯孢属菌。优选的，所述解淀粉芽孢杆菌在芦笋茎枯病中的应用。优选的，所述解淀粉芽孢杆菌用于防治芦笋茎枯病的使用方法为：将解淀粉芽孢杆菌MY001菌剂稀释500～1000倍,分别在芦笋抽芽前期、芦笋抽生期和正常生长期进行喷施，喷施频率为间隔5～10天1次，共计喷施5～10次，整个喷施时间不超过60天。相应的，所述解淀粉芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用，包括将所述解淀粉芽孢杆菌为有效成分应用于植物真菌病害防治，也包括以其代谢产物为有效成分应用于植物真菌病害防治。本专利技术具有以下有益效果：筛选分离出一株新的具有几丁质降解能力的解淀粉芽孢杆菌，MY001,该菌株对造成芦笋茎枯病的病原菌天门冬拟茎点霉菌等真菌具有效果极佳的抑制作用，对于防治芦笋茎枯病具有重要的现实意义。附图说明图1为目标菌株形成的透明水解圈；图2为将目标菌株与芽孢杆菌模式菌株的16SrDNA进行比对的系统进化树；图3为将测序结果与模式菌株的gyrA基因进行多序列比对的系统进化树；图4为将测序结果与模式菌株的gyrB基因进行多序列比对的系统进化树；图5为目标菌株对天门冬拟茎点霉菌的抑制效果对比图；图6为目标菌株对拟盘多毛孢属菌株的抑制效果对比图；图7为目标菌株对弯孢属菌株的抑制效果对比图。具体实施方式实施例一：菌株的筛选1、土壤样品采集：从绵阳芦笋种植区采集土样。2、配制培养基：(1)壳聚糖酶筛选培养基(g/L)：胶体壳聚糖2.0，K2HPO40.7，KH2PO40.3，(NH4)2SO45,MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.01，琼脂12.0，pH＝7.0。(2)肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0,NaCl5.0,pH＝7.0。3、配制试剂：配制胶体壳聚糖:称取细粉壳聚糖10g,加入适量浓盐酸,并在磁力搅拌器上搅拌4～6h使其充分溶解,再用去离子水反复清洗离心(4000r/min)，最后形成胶状物，而后一边搅拌一边缓慢加入NaOH调节pH至中性，即得到胶体壳聚糖，于4℃保存备用。3、菌株的初筛(1)称取5g土样，放入盛有45mL蒸馏水的锥形瓶(250mL)中,搅拌溶解，煮沸30min，然后取上清液进行梯度稀释(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5共5个浓度)，各取100ul涂布于壳聚糖酶筛选培养基中(每个梯度设置2个平行)，置于37℃恒温培养箱中培养2～4d。(2)挑取在选择培养平板上生长且周围有明显透明水解圈的菌落，划线接种于新的壳聚糖酶筛选培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养2d，再挑菌落划线接种，如此进行3代筛选，得到纯种菌株，即为目标菌株。(3)挑取步骤(2)得到的目标菌株单菌落于肉汤培养基中，进行液体培养。然后取5ul培养液置于直径6mm的滤纸片上，滤纸片置于壳聚糖酶筛选培养基上，37℃恒温培养2d，测量透明水解圈的大小。形成的透明水解圈见图1，目标菌株产生的透明水解圈大小见表1。表1目标菌株产生的透明水解圈大小(4)将目标菌株进行提纯、保种，于-80℃条件下贮存。实施例二：菌株鉴定1、16SrDNA测序鉴定提取目标菌株的基因组DNA，以细菌16SrDNA的通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:TACGGTTACCTTGTTACGACTT)从基因组DNA中克隆16SrDNA。PCR结果送上海生工生物公司测序，将测序结果在GeneBank网站(http://www.nicbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST对比，找到并下载标准菌株的基因序列，利用MEGA7.0软件计算不同菌株之间的遗传距离，绘制细菌的系统发育树。16SrDNA测序结果如SEQIDNO1所示。将目标菌株与芽孢杆菌模式菌株的16SrDNA进行比对，利用MEGA7.0构建系统进化树，如图3所示，其中菌株d1与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的遗传距离最近，分别为:0.003和0.009。2、gyrA和gyrB测序鉴定促旋酶的A亚基和B亚基，作为看家蛋白，在进化上保守，大约每100万年基因进化0.7～0.8％，比16SrDNA每5000万年进化1％的速度更快，所以它常用于鉴定亲缘关系更近，无法用16SrDNA区分开的菌株。以目标菌株的基因组DNA为模板，扩增细菌的促旋酶A和B基因。(1)gyrA为通用引物，gyrA-F：5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’；gyrA-R：5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’。对扩增产物进行测序，gyrA测序结果如SEQIDNO2所示。将测序结果与模式菌株的gyrA基因进行多序列比对，利用MEGA7.0构建系统进化树，如图4所示。其中待测菌株与Bacillusamyloliquefaciens的遗传距离最近，为0.053(与其他菌株的遗传距离在0.2以上)。(2)根据16SrDNA鉴定结果,根据几种近缘种的gyrB序列的保守区，设计gyrB的引物，即gyrB-F：5’-AAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：2017年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，MY001.，保藏编号为：CGMCC NO.14460。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：2017年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamyloliquefaciens，MY001.，保藏编号为：CGMCCNO.14460。2.一株解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamyloliquefaciens，其特征在于：其16SrDNA测序序列如SEQIDNO1所示，其gyrA测序序列如SEQIDNO2所示，其gyrB测序序列如SEQIDNO3所示。3.权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用。4.如权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌在植物真菌病害防治中的应用，其特征在于：所述真菌包括：天门冬拟茎点霉菌、拟盘多毛孢属菌、弯孢属...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚刚，苟艳，谢天，蒲莉，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51