DNA寡核苷酸的多对组装制造技术

本发明专利技术提供了用于多重组装寡核苷酸的方法。

Multi pair assembly of DNA oligonucleotides

The invention provides a method for multi recombinant oligonucleotides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA寡核苷酸的多对组装交叉引用本申请涉及2015年10月1日提交的美国临时专利申请序列号62/235,974，其公开内容通过引用整体并入本文。关于联邦资助研究的说明本专利技术是在美国政府的能源部门-劳伦斯伯克利国家实验室-联合基因组研究所奖金号DE-AC02-05CH11231和国立卫生研究院(NIH)奖金号1R21CA160080下进行的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。序列表在此提交的标题为“16-1242-PCT_SequenceListing_ST25.txt”和大小为7kb的序列表通过引用整体并入。
技术介绍
传统上，DNA已经通过固相亚磷酰胺化学合成。基于柱的合成产生多达200元(mer)，差错率约为每200个核苷酸1个，且每个产物的收率为10至100nmol。基于柱的DNA合成受限于对384-孔板的通量，并且寡核苷酸取决于长度和收率花费0.05美元至1.00美元/碱基对(bp)。用亚磷酰胺化学(例如Agilent)和基于半导体的电化学酸生产阵列(例如CustomArray)而进行的基于喷墨的核苷酸印刷的商业化，具有增加的通量并降低了寡核苷酸合成的成本。这些寡核苷酸的成本范围取决于长度、规模和平台为0.00001-0.001美元/bp。然而，这些平台受限于合成长度短、合成误差率高、收率低以及从复杂库中组装长构建体的挑战。近来，许多方法解决了阵列合成的寡核苷酸的高错误率，具有成本和保真度之间的折衷。低成本的方法包括蛋白质，例如MutS、聚合酶和其它结合和切割(cleavage)异源双链体的蛋白质。然而，由于这些方法依赖于识别错配并且要求大部分序列相同，所以它们并不总是与复杂库相容，因此必须在单个基因组装之后进行。此外，由于这些方法保持错误率高达每1000个核苷酸1个，因此需要进一步筛选以确认正确的序列。诸如拨出(Dial-Out)PCR的最近的方法依赖于DNA测序，然后检索序列验证的构建体，实现错误率低至10-7。虽然这些方法可以用于复杂的寡核苷酸池，并且产生非常低的错误率，但是这些方法成本高、时间密集且不总是能回收目标分子。尽管它们的误差率高，但从微阵列切割的廉价寡核苷酸池最近能够对启动子和增强子功能进行高通量分析，为这些调控元件的词汇提供了新的见解。它们也被用于破译遗传变异体在蛋白质功能中的作用。然而，这些研究都受到合成长度短的限制-CustomArray为约160bp，Agilent为约230bp。合成长度短和错误率高对使用阵列衍生的寡核苷酸用于功能测定和基因组装表现出瓶颈。本文描述了将数千个阵列衍生的寡核苷酸组装成接近顺式调控元件和蛋白结构域的长度估计值的靶标的方法。与现有方法相比，这里描述的方法不限制使用限制性酶的序列空间，具有高通量，并且提供检索无错组装的有效方法。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了用于组装一个或多个双链多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)扩增第一多个单链重叠寡核苷酸，其中所述第一多个单链重叠寡核苷酸包含：(i)能够退火以产生一个或多个双链多核苷酸的具有同源性的重叠区域，和(ii)每个单链重叠寡核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；(b)组装一个或多个双链多核苷酸，其中所述组装包括变性、退火和延伸所述第一多个单链重叠寡核苷酸以产生一个或多个双链多核苷酸。本专利技术人已经令人惊讶地发现，本专利技术的方法提供长度在大约200-400或更多个核苷酸之间的数千个多核苷酸的高通量多重组装。此外，本专利技术的方法提供了检索数千个多核苷酸的无错组装的有效方法。这些发现可以为复杂库的生成和基因合成提供方法。例如，创建3118个这种200bp多核苷酸的库比基于柱的合成方法(约0.84美元/靶标)便宜38倍。本专利技术的方法可用于以前所未有的成本合成多核苷酸库，使研究人员能够使用精确设计的序列解决问题，而不是依赖于偏倚诱变方法。此外，本文描述的方法可用于基因合成、基因调控、蛋白质功能和定向进化，所有这些都有助于新药物和更好地理解基因组组织。最后，增加可用低成本、高复杂性DNA合成产生的多核苷酸组装的长度将为蛋白质设计和合成生物学提供新的机会。在一些实施方式中，所述方法还包括：(c)标记所述一个或多个双链多核苷酸，其中所述标记包括使用一对标记引物扩增所述一个或多个双链寡核苷酸以产生一个或多个标记的双链多核苷酸，其中该对标记引物中的每个标记引物包含：(i)包含独特侧翼序列的第一区段，和(ii)包含种子序列的第二区段；(d)对所述一个或多个标记的双链多核苷酸进行测序，其中所述测序包括将所述种子序列结合到测序平台并进行测序反应以识别一个或多个序列验证的多核苷酸；以及(e)检索所述一个或多个序列验证的多核苷酸，其中所述检索包括将互补引物与所述一个或多个序列验证的多核苷酸中的至少一个标记引物的第一区段碱基配对，并且在合适条件和合适试剂的存在下，扩增序列验证的多核苷酸以产生一个或多个验证的多核苷酸；或(c)功能性多肽的表型选择，其中所述表型选择包括酵母展示、噬菌体展示、mRNA展示、核糖体展示、哺乳动物细胞展示、细菌细胞展示、基于乳液的蛋白质选择、一部分基因组的功能互补、或多肽进化领域的专家已知的其它选择方法。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括将两个或更多个双链或验证的多核苷酸逐步组装成组装的多核苷酸产物，其中所述两个或更多个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；以及(f)在适于退火具有同源性的重叠区域的条件和合适试剂的存在下，将两个或更多个双链或验证的多核苷酸组合，所述试剂用于通过延伸双链或验证的多核苷酸来组装初始所需的多核苷酸产物以产生初始所需的多核苷酸产物；以及(g)将初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸组合，其中初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点，并且在合适试剂的存在下组装初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸，所述试剂用于通过延伸初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸来对组装的多核苷酸产物进行组装；以及(h)反复地重复(g)以逐步将另外的下一个双链或验证的多核苷酸添加至初始所需的多核苷酸产物以产生组装的多核苷酸产物。在又一个实施方式中，所述方法进一步包括将两个或更多个双链或验证的多核苷酸分层组装成组装的多核苷酸产物，其中所述两个或更多个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；以及(f)在适于退火具有同源性的重叠区域的条件和合适试剂的存在下，将两个双链或验证的多核苷酸组合，所述试剂用于通过延伸双链或验证的多核苷酸来组装第一所需的多核苷酸产物以产生第一所需的多核苷酸产物；以及(g)用另外的两个双链或验证的多核苷酸重复(f)以产生第二所需的多核苷酸产物；(e)合并第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物，其中第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物具有能够退火的具有同源性的重叠区域以及第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物中的至少一个共同引物结合位点，并且在合适试剂的存在下组装第一所需的多核苷酸产物和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于组装一个或多个双链多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)扩增第一多个单链重叠寡核苷酸，其中，所述第一多个单链重叠寡核苷酸包含：(i)能够退火以产生一个或多个双链多核苷酸的具有同源性的重叠区域，和(ii)每个单链重叠寡核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；(b)组装一个或多个双链多核苷酸，其中，所述组装包括变性、退火和延伸所述第一多个单链重叠寡核苷酸以产生所述一个或多个双链多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.01 US 62/235,9741.一种用于组装一个或多个双链多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)扩增第一多个单链重叠寡核苷酸，其中，所述第一多个单链重叠寡核苷酸包含：(i)能够退火以产生一个或多个双链多核苷酸的具有同源性的重叠区域，和(ii)每个单链重叠寡核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；(b)组装一个或多个双链多核苷酸，其中，所述组装包括变性、退火和延伸所述第一多个单链重叠寡核苷酸以产生所述一个或多个双链多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：(c)标记所述一个或多个双链多核苷酸，其中，所述标记包括使用一对标记引物扩增所述一个或多个双链寡核苷酸以产生一个或多个标记的双链多核苷酸，其中，该对标记引物中的每个标记引物包含：(i)包含独特侧翼序列的第一区段，和(ii)包含种子序列的第二区段；(d)对所述一个或多个标记的双链多核苷酸进行测序，其中，所述测序包括将所述种子序列结合到测序平台并进行测序反应以鉴定一个或多个序列验证的多核苷酸；以及(e)检索所述一个或多个序列验证的多核苷酸，其中，所述检索包括将互补引物与所述一个或多个序列验证的多核苷酸中的至少一个标记引物的第一区段碱基配对，并且在合适条件和合适试剂的存在下，扩增序列验证的多核苷酸以产生一个或多个验证的多核苷酸；或(c)功能性多肽的表型选择，其中，所述表型选择包括酵母展示、噬菌体展示、mRNA展示、核糖体展示、哺乳动物细胞展示、细菌细胞展示、基于乳液的蛋白质选择、一部分基因组的功能互补、或多肽进化领域的专家已知的其它选择方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述一个或多个双链多核苷酸包含至少100、至少200、至少300、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750或至少2000个双链多核苷酸。4.根据权利要求2所述的方法，其还包括将两个或更多个双链或验证的多核苷酸逐步组装成组装的多核苷酸产物，其中所述两个或更多个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；以及(f)在适于退火具有同源性的重叠区域的条件和合适试剂的存在下，将两个或更多个双链或验证的多核苷酸组合，所述试剂用于通过延伸双链或验证的多核苷酸来组装初始所需的多核苷酸产物以产生初始所需的多核苷酸产物；以及(g)将初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸组合，其中初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点，并且在合适试剂的存在下组装初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸，所述试剂用于通过延伸初始所需的多核苷酸产物和下一个双链或验证的多核苷酸来对组装的多核苷酸产物进行组装；以及(h)反复地重复(g)以逐步将另外的下一个双链或验证的多核苷酸添加至初始所需的多核苷酸产物以产生组装的多核苷酸产物。5.根据权利要求2所述的方法，其还包括将两个或更多个双链或验证的多核苷酸分层组装成组装的多核苷酸产物，其中所述两个或更多个双链或验证的多核苷酸具有能够退火的具有同源性的重叠区域和每个双链或验证的多核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；以及(f)在适于退火具有同源性的重叠区域的条件和合适试剂的存在下，将两个双链或验证的多核苷酸组合，所述试剂用于通过延伸双链或验证的多核苷酸来组装第一所需的多核苷酸产物以产生第一所需的多核苷酸产物；以及(g)用另外的两个双链或验证的多核苷酸重复(f)以产生第二所需的多核苷酸产物；(e)合并第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物，其中第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物具有能够退火的具有同源性的重叠区域以及第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物中的至少一个共同引物结合位点，并且在合适试剂的存在下组装第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物，所述试剂用于通过延伸第一所需的多核苷酸产物和第二所需的多核苷酸产物来对组装的多核苷酸产物进行组装；以及(h)重复(f)、(g)和(e)以分层组装成对的所需的多核苷酸以产生组装的多核苷酸产物。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述第一多个单链重叠寡核苷酸中的每个寡核苷酸的核苷酸序列是预定义序列。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一多个单链重叠寡核苷酸中的每个寡核苷酸的所述预定义序列还包含衔接子序列。8.根据权利要求7所述的方法，其中，衔接子序列包含是完全简并序列或部分简并序列的简并序列。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述第一多个单链重叠寡核苷酸源于阵列。10.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·拉乔伊，J·C·克莱因，J·J·施瓦兹，D·贝克，J·A·森迪莱，L·J·斯图尔特，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国,US