冷冻保存有蹄类动物胚胎制造技术

描述了用于移植到受体雌性的冷冻保存有蹄动物胚胎的技术。

Cryopreservation of hoofed embryos

Techniques for transplantation of cryopreserved hoofed animals to recipient females are described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冷冻保存有蹄类动物胚胎交叉引用本申请要求2015年7月14日提交的美国临时申请序列号62/192,544的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
体外胚胎生产是牛育种的主要组成部分。通常生产的胚胎多于植入的胚胎。尽管在玻璃化体外胚胎生产(IVP)的胚胎移植(ET)中，最近已经实现超过30％的受孕率，但玻璃化后的这些胚胎的复苏的复杂过程仍然是该技术的商业应用的障碍。牛胚胎冷冻保存需要新的、有效的方案。
技术实现思路
本专利技术提供了用于冷冻保存的牛胚胎和/或使用冷冻保存的牛胚胎实现受精的技术。本专利技术还提供了冷冻保存的胚胎、这些冷冻保存的胚胎的种群以及用于生产和/或储存它们的系统等。此外，本专利技术还包括利用用于冷冻保存的胚胎的胚胎移植的某些可用技术，特别是用于复苏(例如解冻、植入等)冷冻保存的胚胎的问题源的识别。例如，本专利技术认识到根据许多标准技术复苏有活性的冷冻保存的胚胎所需的人员和时间引起关于其商业适用性的顾虑。此外，本
技术实现思路
还认识到，相对于使用冷冻保存的胚胎的大多数标准技术，需要实现改进的受孕率的冷冻保存的胚胎的移植技术，应当理解的是，这样的标准技术通常实现低于使用新鲜胚胎所实现的受孕率。除此之外，本
技术实现思路
提供了实现冷冻保存的胚胎的期望(例如，约10％或更多)受孕率的技术。在一些实施例中，本专利技术提供了包括以下步骤的方法，例如：获得体外生产的(IVP)有蹄类动物胚胎；冷冻保存胚胎；并且将胚胎移植到受体有蹄类动物中，进行冷冻保存和移植，从而实现至少约10％的妊娠率。在一些实施例中，获得一个或多个体外生产的胚胎包括以下步骤，例如：从雌性中回收一种或多种卵母细胞；体外成熟一个或多个卵母细胞；用精液或一个或多个分离的精子细胞使一个或多个成熟的卵母细胞受精，从而产生一个或多个受精卵；并且剥露和孵育一个或多个受精卵。在一些实施例中，使用的精液是性别分离的。在一些实施例中，精液不是性别分离的。在一些实施例中，体外成熟卵母细胞包括例如：在至少一个选自由温度、气体的存在或量、湿度、pH，渗透压及其组合组成的组的条件的生理相关范围内孵育卵母细胞。在一些实施例中，气体的存在或量选自由O2和CO2组成的组。在一些实施例中，体外成熟卵母细胞的步骤包括：在35-40℃下、3-9％CO2和饱和湿度孵育卵母细胞。在一些实施例中，剥露和孵育受精卵的步骤包括在35-40℃、含5％CO2的空气和饱和湿度下孵育受精卵。在一些实施例中，剥露和孵育受精卵的步骤还包括以5％O2孵育受精卵。在一些实施例中，冷冻保存胚胎包含以下步骤，例如：在包含冷冻保护剂的溶液中孵育胚胎；并将胚胎浸入液氮中。在一些实施例中，冷冻保存胚胎的步骤包括以下步骤：在约10℃至约38℃范围内的第一温度下，在由1.0-4M乙二醇组成的冷冻溶液中孵育胚胎5-30分钟；将胚胎装载到容器中，其中气泡在渗稀释培养基中将胚胎从包含乙二醇的解冻溶液分离；将胚胎暴露于约-2至约-10℃的温度范围内约1分钟至约60分钟范围的时间段；以约每分钟-0.2至大约-0.8℃的范围内的速度降温，直到达到约-30至约-36℃范围内的第二温度；并将胚胎浸入液氮中储存。在一些实施例中，乙二醇以约0.2至约1.3摩尔的范围内的最终浓度呈现。在一些实施例中，将胚胎冷冻保存以直接移植到受体雌性中。在一些实施例中，移植胚胎包括以下步骤：在矿物油作用下，在使用牛血清白蛋白(BSA)补充的培养基中孵育胚胎约5至约9天范围的时间段；并将胚胎移植到受体有蹄类动物中。在一些实施例中，培养基选自由C4培养基、SOF培养基、SOFaa培养基及其组合组成的组。在一些实施例中，培养基补充有血清、胎牛血清、胎牛血清、牛血清白蛋白和/或一种或多种氨基酸中的一种或多种。在一些实施例中，移植的胚胎处于选自由桑椹胚胚、早期胚泡、胚泡和扩张胚泡组成的组的发育阶段。在一些实施例中，同步受体有蹄类动物。在一些实施例中，受体有蹄类动物处于自然发情期。在一些实施例中，胚胎是新鲜的、玻璃化的或冷冻的。在一些实施例中，有蹄动物是牛。在一些实施例中，物种的胚胎选自普通牛、瘤牛以及普通牛与瘤牛的杂交。在一些实施例中，本专利技术提供了通过包括以下步骤的方法生产的冷冻保存的胚胎，例如：获得体外生产的(IVP)有蹄动物胚胎；在一定条件下冷冻保存胚胎，以便当冷冻保存的胚胎移植至受体有蹄类动物时，实现至少约10％的妊娠率。在一些实施例中，获得体外生产的胚胎包括以下步骤，例如：从雌性中回收卵母细胞；体外成熟卵母细胞；用精液使成熟的卵母细胞受精；剥露和孵育受精卵。在一些实施例中，体外成熟卵母细胞包括在至少一个选自由温度、气体的存在或量、湿度、pH，渗透压和其组合组成的组的条件的生理相关范围内孵育卵母细胞。在一些实施例中，移植胚胎包括以下步骤：在矿物油作用下，在补充有牛血清白蛋白(BSA)的培养基中孵育胚胎约5至约9天范围的时间段；并将胚胎移植到受体有蹄类动物中。在一些实施例中，根据本专利技术使用的培养基是或包含选自由C4培养基、SOF培养基、SOFaa培养基及其组合组成的组的培养基。在一些实施例中，培养基补充有血清、胎牛血清、胎牛血清、牛血清白蛋白和/或一种或多种氨基酸中的一种或多种。在一些实施例中，根据本专利技术冷冻保存和/或移植的胚胎处于选自由桑葚胚、早期胚泡、胚泡和扩张囊胚组成的组的发育阶段。在一些实施例中，本专利技术提供一种装置，其包括：容器；位于容器的第一区域内的冷冻保护剂溶液中的冷冻保存的胚胎，第一区域的侧面是：第二区域和第三区域，每个区域含有空气，第二区域和第三区域的侧面是：第四区域和第五区域，每个区域含有解冻溶液，第四区域和第五区域的侧面是：第六区域和第七区域，每个区域含有空气，第六区域和第七区域的侧面是第八区域和第九区域，每个区域含有解冻溶液。在一些实施例中，一个或多个区域是腔室，其中腔室由物理分隔实体界定，该物理分隔实体在它与至少一个与其相邻的其他区域之间提供屏障。在一些实施例中，本专利技术提供了多个装置。在一些实施例中，本专利技术提供了包括以下步骤的方法：冷冻保存多个有蹄类动物胚胎；并且将多个胚胎移植到受体有蹄类动物中，其中进行冷冻保存和移植，从而实现至少30％的受孕率。在一些实施例中，将冷冻保存溶液中的每个胚胎冷冻保存的步骤：将胚胎定位在容器的第一区域内，第一区域的侧面为：第二区域和第三区域，每个区域含有空气，第二和第三区域的侧面为：第四区域和第五区域，每个区域含有解冻溶液，第四区域和第五区域的侧面是：第六区域和第七区域，每个区域含有空气，第六区域和第七区域的侧面为：第八区域和第九区域，每个区域含有解冻溶液。在一些实施例中，本专利技术提供冷冻胚胎的方法，例如包括：使有蹄类动物胚胎在35℃下暴露于由约1至约4M乙二醇组成的冷冻溶液(SC)10分钟；将每个胚胎放置到吸管尺寸的容器内的冷冻溶液(SC)中，使得冷冻溶液中的胚胎被四列解冻溶液(SD)围绕，并且在它们之间由空气柱穿插，其中解冻溶液包含约0.75M的乙二醇；将容器暴露在稳定在约0℃至约-10℃范围内的温度的温度条件下；放置在冷冻机中两分钟后在胚胎上方和下方结晶柱；在约0℃至约-10℃范围内的温度下保持胚胎1至60分钟；以每分钟约-0.2℃至约0.8℃的速度降温，直到达到约-30℃至约-36℃范围内的第二温度；并将冷本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括以下步骤的方法：获得体外生产的(IVP)有蹄类动物胚胎冷冻保存所述胚胎；和将胚胎移植到受体有蹄类动物中，进行所述冷冻保存和移植以实现至少约10％的妊娠率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.14 US 62/192,5441.包括以下步骤的方法：获得体外生产的(IVP)有蹄类动物胚胎冷冻保存所述胚胎；和将胚胎移植到受体有蹄类动物中，进行所述冷冻保存和移植以实现至少约10％的妊娠率。2.如权利要求1所述的方法，其中获得体外生产的胚胎的所述步骤包括以下步骤：从雌性中回收卵母细胞；体外成熟卵母细胞；用精液使成熟的卵母细胞受精，从而产生受精卵；和剥露和孵育所述受精卵。3.如权利要求2所述的方法，其中所述精液是性别分离的。4.如权利要求2所述的方法，其中所述精液不是性别分离的。5.如权利要求2的方法，其中体外成熟卵母细胞的所述步骤包括：在选自由温度、气体的存在或量、湿度，pH、渗透压及其组合组成的所述组的至少一种条件的生理相关范围内孵育卵母细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中气体的所述存在或所述量选自由O2和CO2的组成的所述组。7.如权利要求2的方法，其中体外成熟卵母细胞的所述步骤包括：在35-40℃下用3-9％CO2和饱和湿度孵育卵母细胞。8.如权利要求2所述的方法，其中剥露和孵育受精卵的所述步骤包括在35-40℃下用含有5％CO2的空气和饱和湿度孵育所述受精卵。9.如权利要求8所述的方法，其中剥露和孵育受精卵的所述步骤还包括以5％O2孵育所述受精卵。10.如权利要求1所述的方法，其中冷冻保存胚胎的所述步骤包括以下步骤：在包含冷冻保护剂的溶液中孵育胚胎；和将所述胚胎浸入液氮中。11.如权利要求1所述的方法，其中冷冻保存所述胚胎的所述步骤包括以下步骤：在约10℃至约38℃范围内的第一温度下，在含有1.0-4M乙二醇的冷冻溶液中孵育胚胎5-30分钟；将所述胚胎装载到容器中，其中在等渗稀释培养基中，气泡从含有乙二醇的解冻溶液中分离胚胎；将所述胚胎暴露于在约-2至约-10℃范围内的温度，约1分钟至约60分钟范围内的时间段；以每分钟约-0.2至大约-0.8℃的范围内的速度降低所述温度，直到达到约-30至约-36℃范围的第二温度；和将所述胚胎浸入液氮中储存。12.如权利要求11所述的方法，其中所述乙二醇以约0.2至约1.3摩尔的范围内的最终浓度存在。13.如权利要求10所述的方法，其中将胚胎冷冻保存以直接移植到受体雌性中。14.如权利要求1所述的方法，其中移植胚胎包括以下步骤：在矿物油作用下，在补充有牛血清白蛋白(BSA)的培养基中孵育胚胎约5至约9天范围内的时间段；和将所述胚胎转移到受体有蹄类动物中。15.如权利要求14所述的方法，其中所述培养基选自由C4培养基、SOF培养基、SOFaa培养基及其组合组成的所述组。16.如权利要求14的方法，其中所述胚胎处于选自由包括桑葚胚、早期胚泡、胚泡和扩张囊胚组成的所述组的发育阶段。17.如权利要求1所述的方法，其中同步所述受体有蹄类动物。18.如权利要求1所述的方法，其中所述受体有蹄类动物处于自然发情期。19.如权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是新鲜的、玻璃化的或冷冻的。20.如权利要求1所述的方法，其中所述有蹄类动物是牛。21.如权利要求20所述的方法，其中所述胚胎选自包括普通牛、瘤牛和瘤牛-普通牛的杂交品种的牛的种类。22.通过包括以下步骤的方法生产的冷冻保存的胚胎：获得体外生产的(IVP)有蹄类动物胚胎；在一定条件下冷冻保存所述胚胎，以便当所述冷冻保存的胚胎移植到受体有蹄类动物时，实现至少约10％的妊娠率。23.如权利要求22所述的胚胎，其中获得体外生产的胚胎包括以下步骤：从雌性中回收卵母细胞；体外成熟的卵母细胞；用精液使成熟的卵母细胞受精；和剥露和孵育受精卵。24.如权利要求23所述的胚胎，其中体外成熟卵母细胞包括在至少一种选自由温度、气体的存在或量、湿度、pH、渗透压及其组合组成的所述组的生理相关范围内孵育卵母细胞。25.如权利要求22的所述的胚胎，其中移植胚胎包括以下步骤：在矿物油作用下，在补充有牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·V·桑切斯，
申请(专利权)人：吉纳斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US