猪胚胎冷冻保存方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，其中使用玻璃微细管作为冷冻胚胎的承载工具，所述的玻璃微细管至少有一端的内径为０．１－１ｍｍ，这种冷冻方法成本低，成功率高。本发明专利技术还公开了由此方法所获得的猪胚胎及其用途。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体地涉及哺乳动物胚胎的冷冻保存。
技术介绍
哺乳动物胚胎的冷冻保存开始于1972年，由Whittingham等(1972)首先专利技术了慢速冷冻法(常规冷冻法)，在小鼠上取得胚胎冷冻成功；1977年Willadson等对上述方法进行了改良，专利技术了快速冷冻法，相继在大鼠、牛、兔、山羊、绵羊等动物上获得成功，目前牛胚胎冷冻技术已达到商业化水平。但这些方法冷冻程序较繁琐、费时，而且冷冻过程中需要昂贵的程序降温仪。1985年Rall等首次专利技术了玻璃化冷冻方法，对小鼠8-细胞冷冻保存取得成功。此后研究者不断改进，使这项技术日趋成熟，有逐渐替代传统方法的趋势。猪胚胎超低温冷冻对地方猪种的长期保存意义重大。长期以来，由于猪胚胎脂质含量较高等原因，进展一直较为缓慢。猪的卵母细胞和胚胎脂滴含量较高，与其他家畜(牛、羊等动物)相比对低温的耐受性较差，其研究一直处于探索阶段(Hayashi等，1989；Kashiwazki等，1991；Fujino等，1993；Dobrinsky等，1997；冯书堂等，1991；王祖昆等，1998；徐晓波等，1996)；虽然通过离心、显微操作去除脂滴后在一定程度上提高了冷冻效率，但这些方法的重复性不好(Nagashima等，1994；Hiroshi等，1998)；自Vajta等人在1997年首次报道利用开放性拉细麦管(OPS，open pulled straw)玻璃化方法冷冻猪胚胎，使胚胎解冻活率、受胎率有了较大的提高(Vajta等，1997；Berthelot等，2000；2001；Misumi等，2003)。但OPS拉制有一定的难度，当OPS管拉至0.8mm时，在狭窄处变得很脆，易于裂口；另外OPS管在液氮中容易上浮和炸裂，难于储存，成功率低，损耗严重。因此，本领域迫切需要一种新的猪胚胎超低温冷冻承载工具，从而使运用此新的承载工具的冷冻方法，成本低，成功率高。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种猪胚胎超低温冷冻方法。本专利技术的另一个目的是提供用上述的猪胚胎超低温冷冻方法是获得的猪胚胎，以及它的用途。本专利技术的再一个目的是提供一种可用作猪胚胎超低温冷冻方法中的承载工具的玻璃管。在本专利技术的第一方面，提供了一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，它包括步骤(a)在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理，(b)将步骤(a)获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；(c)将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.1-1mm。在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.2-0.8mm。更佳地为0.3-0.5mm，最佳为0.3mm。在另一优选例中，所述的玻璃管剖面基本为圆形，至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.06mm。在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端开口。在另一优选例中，所述的玻璃管剖面内径为0.1-1mm的一段有20-30mm。在另一优选例中，所述的对离体胚胎进行冷冻预处理是将胚胎在渗透性防冻保护剂中放置2-6分钟，所述的渗透性防冻保护剂含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇和二甲亚砜。在另一优选例中，所述的渗透性防冻保护剂含有40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、5-20％乙二醇和5-20％二甲亚砜。在另一优选例中，所述的胎牛血清为新出生的牛的血清。在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇、二甲亚砜和蔗糖。在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、10-30％乙二醇、10-30％二甲亚砜和0.2-0.6M蔗糖。在另一优选例中，步骤(c)中在液氮中保存2-5个月。在另一优选例中，步骤(b)中将1-5μl含胚胎的冷冻液吸入胚胎冷冻载体中。在另一优选例中，步骤(c)中胚胎与玻璃化溶液的混合物在10-100秒内吸入冷冻载体中。在另一优选例中，所述的胚胎为囊胚或桑椹胚。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(d)在基础液中解冻后保存在基础液中，所述的基础液含有TCM199培养液、胎牛血清。在另一优选例中，所述的基础液含有60-90％TCM199和10-40％胎牛血清。在另一优选例中，解冻时基础液中加入0.03-0.3M蔗糖。在本专利技术的第二方面，提供了一种用上述方法获得的冷冻猪胚胎。在另一优选例中，所述的胚胎为桑椹胚或囊胚。在本专利技术的第三方面，提供了一种上述冷冻猪胚胎的用途，它可用于猪胚胎移植。在本专利技术的第四方面，提供了一种玻璃管的用途，所述的玻璃管可用作玻璃化冷冻猪胚胎方法中的冷冻猪胚胎承载体。据此，本专利技术提供了一种新的猪胚胎超低温冷冻承载工具，并使运用此新的承载工具的冷冻方法，成本低，成功率高。附图说明图1显示了猪胚胎超低温冷冻承载工具GMP(玻璃微细管)，直径0.3mm。图2显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻的过程，其中a表示第一步，在含有10％乙二醇和10％二甲亚砜的预处理液中孵育3分钟；b表示第二步，在含有20％乙二醇、20％二甲亚砜和0.4M蔗糖的玻璃化溶液中孵育1分钟；c表示在液氮中冷却的步骤。图3显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻后的解冻过程。图4显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻所获得的猪胚胎移植后所产生的1日龄的后代。图5显示了应用GMP进行猪胚胎超低温冷冻所获得的猪胚胎移植后所产生的4月龄的后代。具体实施例方式专利技术人经过广泛而深入的研究，意外地发现利用GMP(glass micropipette玻璃微细管)作为猪胚胎超低温冷冻的承载工具，热传导性能好，降温速率快，冷冻效果好；拉制容易，可拉得极细而不破裂；易于在液氮中保存；而且所获得的猪胚胎移植后具有较高的妊娠率和存活率。如本文所用，“冷冻胚胎承载工具”、“冷冻胚胎载体”、“冷冻胚胎承载体”、“承载工具”、“载体”、“承载体”可互换使用，都是指在玻璃化冷冻胚胎过程中装盛冷冻胚胎的用具，以便于在液氮中保存。如本文所用，GMP是指至少有一端内径0.1-1mm，管壁0.01-0.1mm的玻璃管。冷冻胚胎承载工具本专利技术的冷冻胚胎承载工具可以是本领域熟知的玻璃化冷冻胚胎技术中所使用的承载体。一种优选的承载体是玻璃管，更优选GMP。本专利技术的冷冻胚胎承载工具的横截面可以是任意形状，优选基本圆形。本专利技术的冷冻胚胎承载工具至少有一端是开口的，优选内径0.1-1mm、管壁0.01-0.1mm的一端开口。本专利技术的冷冻胚胎承载工具长度为5-10cm，优选剖面内径为0.1-1mm的一段的长度为10-20mm的GMP。本专利技术的冷冻胚胎承载工具可以用本领域熟知的方法制得。一种优选的方法是将内径为2-4mm的玻璃管在酒精灯外焰上加热煅烧，当煅烧部分变得很柔软后，脱离火焰用双手捏住玻璃管两端迅速向相对的方向牵拉，拉制成内径为0.1-1mm的微管，用作胚胎冷冻载体。玻璃化胚胎冷冻方法超低温冷冻胚胎的存活取决于渗透性抗冻保护剂通透性的快慢、化学毒性的大小和非渗透性抗冻保护剂的渗透压作用及有无冰晶生成。本专利技术的玻璃化胚胎冷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，其特征在于，包括步骤：（ａ）在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理；（ｂ）将步骤（ａ）获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；（ｃ）将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。

【技术特征摘要】
1.一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，其特征在于，包括步骤(a)在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理；(b)将步骤(a)获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；(c)将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.1-1mm。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.2-0.8mm。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玻璃管剖面基本为圆形，至少有一端...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德福，刘东，吴华莉，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]