一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中间体2’‑脱氧鸟苷的制备方法，构建新颖的N‑核苷脱氧核糖转移酶的重组菌株，经自诱导表达合成重组N‑核苷脱氧核糖转移酶，并采用干粉投料方式加入底物通过生物催化法高效制备2’‑脱氧鸟苷，制得的2’‑脱氧鸟苷产率高，成本低。

Preparation of an intermediate 2 '- deoxy guanosine

The invention discloses a preparation method of an intermediate 2 'deoxyguanosine, and constructs a novel recombinant strain of N nucleoside deoxyribose transferase, and syntheses recombinant N nucleoside deoxyribose transferase by self induced expression, and uses dry powder feeding method to prepare 2' purified deoxyguanosine by biocatalysis, and the preparation of deoxyribose is prepared by biocatalysis. The yield of 2 'deoxy glucoside is high and the cost is low.

【技术实现步骤摘要】
一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法。
技术介绍
2’-脱氧鸟苷是一种天然的脱氧核苷，可直接用于制备组合脱氧核苷药物或者作为化学试剂用于生化研究，也可对其分子结构进行适当修饰来合成分子标记物（如8-溴-2’-脱氧鸟苷、8-羟基-2’-脱氧鸟苷、N7-鸟嘌呤烷化物）和抗肿瘤衍生物（如2’-脱氧鸟苷6-甲氧基或6-氨基-衍生物）。目前商业化生产2’-脱氧鸟苷主要采用化学合成，由于化学合成步骤长、副产物多、总收率偏低等种种不足，所以，研究人员开始着手于采用生物法来制备2’-脱氧鸟苷。采用生物法制备2’-脱氧鸟苷主要有两种方式来实现，所对应使用的酶分别是核苷磷酸化酶和N-脱氧核苷核糖转移酶，一般以胸苷为脱氧糖基供体，以鸟嘌呤为脱氧糖基受体，在一定条件下，在酶的催化作用下进行糖基交换反应生成脱氧鸟苷。由于鸟嘌呤在反应体系中溶解度极低，从而导致了极低的转化率和脱氧鸟苷产率。为了提高脱氧鸟苷产率，可以通过添加助溶剂来增加鸟嘌呤在反应体系的溶解度，或者使用溶解度比鸟嘌呤大的前体物来替代鸟嘌呤。中国专利申请号201510140553.1公开了采用双水相体系提高鸟嘌呤的溶解度，大大提高了转化率和脱氧鸟苷产率；中国专利申请号201010611733公开了采用鸟苷酸为鸟嘌呤的前提物，采用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶和磷酸单酯酶双酶作用下催化合成2’-脱氧鸟苷；中国专利申请号200510137532公开了先将鸟嘌呤与乙二醛进行反应生成乙二醛-鸟嘌呤衍生物来提高鸟嘌呤的溶解度，转化完毕后再经碱解脱去乙二醛基团生成2’-脱氧鸟苷；欧洲专利EP1457568、美国专利US20050170470A1、美国专利US6197552、世界专利WO2003057895A1以及文献（JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic，2000，10：207–213）报道采用鸟苷酸、2-氨基-6-氯嘌呤或者2，6-二氨基嘌呤作为糖基受体来制备2’-脱氧鸟苷前提物（如5’-单磷酸2’-脱氧鸟苷、2-氨基-6-氯-2’-脱氧核苷、2，6-二氨基-2’-脱氧核苷），然后再经酶处理得到脱氧鸟苷。虽然上述报道中所采用措施对提高鸟嘌呤溶解度或者脱氧鸟苷产率方面取得一定成效，但还存在一些不足之处，如双水相体系不利于后续纯化、鸟嘌呤前体物方面还需额外通过化学法脱保护基团或酶法脱氨或脱氯转化、以及生物催化所用酶活力不高等。因此，提高鸟嘌呤溶解度和构建高活力的产酶菌株是提高脱氧鸟苷产率的有效措施。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术提供一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法，通过分子克隆手段，构建新颖的N-核苷脱氧核糖转移酶的重组菌株，经自诱导表达合成重组N-核苷脱氧核糖转移酶，并采用干粉投料方式加入底物通过生物催化法高效制备2’-脱氧鸟苷。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株，重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株-大肠杆菌DNTase-1EscherichiacoliDNTase-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2017060，保藏时间为2017年2月23号，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株-大肠杆菌DNTase-1EscherichiacoliDNTase-1氨基酸人工序列为：MNKKKTLYFGAGWFNEKQNKAYKEAMAALKENPTVDLENSYVPLENQYKGIRIDEHPEYL60HNIEWASATYHNDLVGIKTSDVMLGVYLPEEEDVGLGMELGYALSQGKYILLVIPDEDYG120KPINLMSWGVCDNAIKISELKDFDFNKPRYNFYDGAVY158。重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株大肠杆菌DNTase-1EscherichiacoliDNTase-1的核酸人工序列为：cttgtcataaacttcttttaaaaccaaatcttgcttaatttgatctgttacaaaaactgc60atctggggcaaaaaaattttcagtattagtcattgaattttaccttccattatggaatta120ctatttttagcgtaagttaacaagacgtttttttcaatcgaaaatatgttaaagttaatt180cgtcagcaatttttatggggagaaaattatgaacaagaaaaagactttatattttggtgc240cggttggtttaatgaaaagcaaaacaaagcttacaaagaagcaatggcagctttaaaaga300aaatccaacagttgatttagaaaatagttatgtgccccttgaaaaccaatacaagggtat360tcgcattgatgaacatccagaatacttgcacaacattgaatgggcttctgcaacctacca420caatgatttagtaggaattaagacttctgatgtcatgcttggcgtatatttgccagaaga480agaagacgtcggcttaggcatggaactgggctacgcattatctcaaggaaaatatatttt540attggttatcccagatgaagattacggcaagccaatcaacttaatgagctggggcgtttg600tgacaatgccatcaagatcagtgaattaaaagacttcgactttaacaagcctcgctacaa660tttctacgacggagctgtatattaaaaaataagcaaactaaatgacctatcgcttaaaaa720ttgcgataggtcattttttaatattatctgtcatgtataaaatctttcttaataaatata780ctccaagtgattttccaaaaaaattattattctatacccacttcatatggaagtccgagt840cacttatgtaaatcatatatcacttggcatattatcttactactaagttgttatttagct900ttcaatgcccattggtatcacaagcctttctttatatctgactaactacactaactatgt960cattggcctcaccttttctttttaatattatttcttaatttttttacactcataatatag1020cacatttctcccaaaagtaaaagcgcttacattaaaataaagattaatttttctttgact1080actatccttttagcataattgcacaaaaagttaagattttttcgctataatatatggtaa1140caagttttattaggaagaaagcaatatgacacaaaatcaaatagaaagacatcaattagg1200tcaactcatcggtgcgaataaacgtgatcattactatgaacttcactattctaccggaga1260agttgctcgtc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组N‑核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株，重组N‑核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株大肠杆菌 DNTase‑1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC No：M 2017060，保藏时间为2017年2月23号，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

【技术特征摘要】
1.一种重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株，重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株大肠杆菌DNTase-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2017060，保藏时间为2017年2月23号，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种重组N-核苷脱氧核糖转移酶的制备方法，其特征在于：将重组N-核苷脱氧核糖转移酶的工程菌株大肠杆菌DNTase-1接入培养基进行诱导培养，从而获得重组表达的N-核苷脱氧核糖转移酶。3.根据权利要求2所述的一种重组N-核苷脱氧核糖转移酶的制备方法，其特征在于：所述培养基为自诱导培养基：酵母浸粉20g/L，鱼蛋白胨12.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，氯化钠5.0g/L，七水合硫酸镁1.0g/L，乳糖3.2g/L，甘油5.5g/L，pH6.5；培养条件为：培养温度32℃，时间24h。4.一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法，其特征在于：重组N-核苷脱氧核糖转移酶的大肠杆菌工程菌株发酵培养完毕后，将发酵液转入生物催化反应器中，按照生物催化反应条件，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李保山，李海存，王洪钟，黄爱清，宋长红，
申请(专利权)人：山东格得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37