制备L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的方法技术

本发明专利技术涉及一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株制备L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的方法。重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明专利技术采用基因重组和定点突变技术，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。以发酵所得菌体细胞为生物催化剂，在柠檬酸三钠缓冲液体系中，以蔗糖和L‑抗坏血酸为原料制备AA‑2G。本发明专利技术直接采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。同时产物单一，反应产物主要为AA‑2G，收率高达65%，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法（一）
本专利技术涉及生物催化剂制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的
，具体涉及一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法。（二）
技术介绍
L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷,即2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbidacid，AA-2G），是由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系年共同发现的一种的L-抗坏血酸（即维生素C）的葡萄糖苷衍生物（J.Biochem.107,222-227(1990)；Agric.Biol.Chem.,54(7),1697-1703（1990）；US5084563（1992））。它具有抗坏血酸的生理活性，同时由于L-抗坏血酸的2位C上的羟基以α-1，4糖苷键与葡萄糖相连接形成稳定的稳定的糖苷键，显著降低L-抗坏血酸的还原性，稳定性大大提高。目前，AA-2G主要应用于化妆品行业，具有抗UV、抑制黑色素等美白功效作用。日本学者最早发现AA-2G时，是采用来源于根霉属或毛霉属的a-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，α-Glucosidase）作为催化剂剂，但是AA-2G产物浓度极低，后来发现使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）的环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC2.4.1.19，CyclomaltodextrinGlucanotransferase，简称CGTase）作为催化剂，以环糊精和L-抗坏血酸为原料制备AA-2G，转化率提高至45%（Agric.Biol.Chem.,55(7),1751-1756,1991）。后来陆续报道一些其他糖基转移酶也能以相应糖基供体（如麦芽糖、低聚糊精、淀粉等）和L-抗坏血酸及钠盐为原料来生物催化合成AA-2G。所以，目前所报道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，α-Glucosidase）（US3763009（1973））、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC2.4.1.19，CyclomaltodextrinGlucanotransferase，简称CGTase）（US5084563（1992）、US5137723（1992）、和US5407812（1995）、US9265781B2（2016））、α-淀粉酶（EC3.2.1.1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7，Sucrosephosphorylas）（BiotechnolLett29:611–615，2007）、葡聚糖蔗糖酶（EC2.4.1.5，Dextransucrase）（MicrobiologicalResearch165：384-391，2010）、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶（US20060216792（2006）、US8759030（2014）和CN201510179664（2015））等6类酶。目前AA-2G工业化生产上采用CGTase为生物催化剂，但是采用路线还存在以下不足之处：一是生产所用的CGTase酶为商业化酶制剂，而不是采用最为直接的CGTase发酵液或者含CGTase酶的菌体细胞，究其原因是目前CGTase发酵酶活力普遍不高，酶活力低无法满足制备AA-2G的酶活要求；另外，若采用CGTase发酵液或菌体为催化剂，则需要经菌体破碎、浓缩等操作步骤达到制备AA-2G的酶活要求。二是除生成目标产物AA-2G外，还会生成一系列的二糖、三糖、四糖以及五糖等多糖基衍生物，还需额外添加a-糖化酶进行水解多糖基衍生物转化成目标产物AA-2G，增加工艺步骤。三是糖基供体环糊精水溶性差、价格高等缺陷，不利于转化，原料成本高。四是生成10%左右的AA-5G（5-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸）和AA-6G（6-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸）混合副产物（US5272136（1993），US5468850（1995）），不利于后续分离纯化。尽管后来美国专利US20060216792（2006）和US8759030（2014）报道了为了避免CGTase催化反应中形成AA-5G和AA-6G副产物，采用来源于球状节杆菌（ArthrobacterglobiformisA19）α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶为催化剂制备AA-2G，但酶源不易获得。基于上述存在不足之处，我们使用蔗糖磷酸酶作为生物催化剂来制备AA-2G，因为采用蔗糖磷酸酶作为催化剂，有以下优势潜力：一是蔗糖磷酸化酶（SPase）分布广泛，存在于绝大多数细菌等微生物中，发酵酶活高，不需采用商业用酶制剂或者菌体破壁、浓缩处理，可以直接使用发酵液或菌体作为生物催化剂。二是蔗糖磷酸化酶采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。三是产物单一，反应产物主要为AA-2G和果糖，不需额外添加糖化酶处理。四是反应条件温和，反应温度为30-37℃，热能耗较低。（三）
技术实现思路
本专利技术基于目前AA-2G工业化生产上存在的不足之处，以及目前所报道的采用蔗糖磷酸化酶制备AA-2G的不成熟现况，提供了一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法，其采用定点突变技术，构建新的蔗糖磷酸化酶高产工程菌株，采用该重组工程菌株生物催化制备AA-2G，产物单一，收率高，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特殊之处在于：重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCCM2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。蔗糖磷酸化酶DNA人工序列：TAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCA50TCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTA100GCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAAAAACAAAGT150GCAGCTCATCACATACGCCGATCGTCTCGGCGATGGCACTCTTAGCTCGA200TGACCGACATCCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTATGACGGCGTGCAT250ATCCTGCCGTTCTTCACTCCGTTCGATGGTGCGGATGCAGGCTTCGACCC300GATCGACCATACCAAAGTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTC350GCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATCATGGTCGACGCCATCGTCAACCA400CATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAAGACGTGCTTGAAAAAGGTGAG450GAATCCGAGTATTACCCGATGTTCCTGACCATGAGCTCCGTCTTCCCGAA500CGGCGCCACCGAAGAAGACCTGGCCGGCATCTACCGCCCGCGCCCGGGC550CTGCCGTTCACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACGCGCTTGGTCTGGGT600GAGCTTCACCCCGCAGCAGGTGGACATCGACACTGATTCCGCCAAGGGTT6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特征在于：重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

【技术特征摘要】
1.一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特征在于：重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCCM2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：采用基因重组和定点突变技术，将源自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因进行克隆表达，构建重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株。3.根据权利要求2所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：将来自长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶编码基因通过pet28a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。4.根据权利要求3所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：A1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株的构建，包括以下步骤：A1.1、将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代n次，以该菌液为DNA模板，并以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物，然后进行PCR反应，经琼脂凝胶分离纯化回收获得目标基因DNA片段；A1.2、将获得的目标基因DNA片段和pet28a(+)质粒构建双酶切反应体系，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，再经凝胶回收，最后经DNA连接构建重组质粒；A1.3、将构建重组质粒转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中形成转化克隆菌株pet28a(+)-spase，再经验证获得目标重组质粒；A2、蔗糖磷酸化酶表达菌株的构建，包括以下步骤：A2.1、将含目标重组质粒的阳性克隆菌株于LB培养基中进行培养，再经提取获得目标重组质粒；A2.2、将提取获得的目标重组质粒与感受态的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体进行转化，经平板分离获得克隆菌落，再经PCR验证获得目标蔗糖磷酸化酶表达菌株pet28a(+)-spase-BL21(DE3)；A3、采用PCR定点突变技术，其步骤包括突变位点氨基酸的突变引物设计，然后进行突变质粒克隆菌株的构建、突变质粒表达菌株的构建，再经PCR验证获得定点突变阳性表达菌株，即重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。5.根据权利要求4所述的重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的制备方法，其特征在于：步骤A1蔗糖磷酸化酶克隆菌株构建中：将冻存的长双歧杆菌进行复苏培养传代n次，以该菌液为DNA模板，以NCBI上长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因序列为模板设计一对引物：正向引物(spase-bam-F):5’CGCGGATCCATGAAAAACAAAGTGCAGCTCATC3’反向引物(spase-hind-R):5’CCCAAGCTTGTCGATATCGGCAATCGG3’然后进行PCR反应，反应条件为：92-98℃预变性0.5-2min，然后20-40个循环（92-98℃5-15S，49℃～64℃10-15S，68-75℃18-25S），68-75℃再延伸3-7min；PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pet28a(+)质粒的DNA溶液组成BamHⅠ和HindⅢ双酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为32-42℃温度下酶切反应2-7min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，再10-20℃循环水浴中反应过夜；DNA过夜连接完毕后，将10μl连接产物全部加入45-55μl刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄爱清，王永桥，宋长红，王金才，朱嘉震，王洪果，史峻嵩，
申请(专利权)人：山东格得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37