本发明专利技术公开了一株副干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用，属于微生物领域。本发明专利技术的副干酪乳杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M2017791的副干酪乳杆菌TC16，该菌株可投放到养殖水体中以去除亚硝酸盐或添加到畜禽水产动物的饲料或饮水中。本发明专利技术菌株能够降低养殖水体亚硝酸盐浓度，用于水产养殖中，提高水产动物存活率和产量，具有工业化开发和推广应用的潜力。
Lactobacillus paracei and its application in aquaculture
The invention discloses a Lactobacillus paracei and its application in aquaculture, belonging to the field of microorganisms. The Lactobacillus paresiacum cheeseni is a Lactobacillus paraged Lactobacillus casei TC16 named CCTCC NO:M2017791, which can be put into the aquaculture water to remove nitrite or add to the feed or drinking water of livestock and aquatic animals. The strain can reduce the concentration of nitrite in aquaculture water, and can be used in aquaculture to improve the survival rate and yield of aquatic animals. It has the potential for industrial development and application.
【技术实现步骤摘要】
一株副干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用。
技术介绍
随着淡水水产养殖规模的不断扩大，集约化程度不断提高，养殖水体中亚硝酸盐严重超标已经成为我国水产养殖业发展急需解决的问题。养殖水体中的亚硝酸盐处理包括物理、化学和微生物方法，其中微生物方法因能保证养殖生物的安全性和产品质量而备受瞩目。乳酸菌是一群能从可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰阳性细菌的通称，在自然界里广泛存在，是地球生物圈的一个重要成员。作为饲用的微生物添加剂，乳酸菌类益生菌是目前我国农业部、美国食品及药物管理局等国内外政府部门批准使用的数量最多的安全的微生物菌种。乳酸菌在调节微生态平衡、营养助消化、促进水产养殖动物生长、增强免疫力、减少肠道有害产物和养殖环境中的臭味、提高苗种的成活率等方面有积极的作用。本专利技术从养殖水体中分离得到一株具有优良益生性能的副干酪乳杆菌TC16，建立了以麸皮豆粕为主要基质的高密度固体发酵工艺。水产养殖应用试验表明，该菌剂能够养殖水体亚硝酸盐浓度，提高水产动物存活率和产量，具有工业化开发和推广应用的潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株具有优良益生性能的副干酪乳杆菌及其在水产养殖中的应用，该菌株能够降低养殖水体亚硝酸盐浓度，提高水产动物存活率和产量，具有工业化开发和推广应用的潜力。本专利技术的目的还在于提供所述副干酪乳杆菌的高密度固体发酵方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一株副干酪乳杆菌，为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)TC16，该菌株已于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为：副干酪乳杆菌TC16LactobacillusparacaseiTC16，保藏编号为：CCTCCNO：M2017791。所述副干酪乳杆菌的高密度固体发酵方法，包括如下步骤：(1)将副干酪乳杆菌TC16接种于MRS液体培养基，35-40℃培养24-36h，至OD600值达到2.0-5.0，得到种子液。(2)将培养的种子液按5-8％(V/W)的接种量接种固体发酵培养基，37-42℃培养24-36h。其中，所述固体发酵培养基配方为：麸皮250g，豆粕750g，料水比1:1，按麸皮豆粕总质量添加海藻糖5％、硫酸锰0.01％；所述料水比即为麸皮豆粕与水的质量比；应理解，麸皮250g、豆粕750g表示两者之间的比例关系。一种副干酪乳杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：往上述高密度固体发酵方法的产物中加入固体发酵培养基2-3倍质量的硅藻土作为保护剂，45℃低温干燥粉碎，得到副干酪乳杆菌菌剂。所述副干酪乳杆菌可用于水产养殖中，其可以有效去除养殖水体中亚硝酸盐，维护水体微生态平衡。对虾养殖实验结果显示副干酪乳杆菌TC16能有效提高对虾存活率并显著降低水体亚硝酸盐含量，并促进对虾生长。所述副干酪乳杆菌在畜禽水产养殖中应用的方法，包括如下步骤：将副干酪乳杆菌TC16菌剂单独或与其他微生物菌剂复合，按0.01～0.3％(w/w)比例添加到畜禽水产动物的饲料或饮水中。副干酪乳杆菌TC16在动物饲喂中安全性好，在畜禽养殖生产的不同阶段饲喂可以用于改善肠道健康、防止便秘、防治细菌性腹泻、促进肠道吸收从而提高生产性能。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术的副干酪乳杆菌TC16能降低养殖水体中亚硝酸盐含量，能维持水产动物肠道微生态平衡，促进水产动物生长。(2)本专利技术高密度固体发酵副干酪乳杆菌TC16的方法，与液态发酵相比，设备简单、技术难度低、成本低廉。附图说明图1是投加副干酪乳杆菌TC16对亚硝酸盐降解的结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1副干酪乳杆菌TC16的筛选与鉴定(1)从武汉天辰生物科技有限公司对虾养殖塘中采集水样，将水样在MRS液体培养基中37℃好氧富集培养浑浊，适当稀释后涂平板培养72h，根据菌落形态挑取典型乳酸菌单菌落(白色，大小1-2mm，湿润隆起)，通过镜检粗筛出乳酸菌。MRS液体培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母粉5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.2g、吐温801mL、硫酸锰0.05g，水1000mL，调pH6.0，115℃灭菌20min。MRS固体培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母粉5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.2g、吐温801mL、硫酸锰0.05g琼脂18g，水1000mL，调pH6.0，115℃灭菌20min。(2)通过生理生化、16SrDNA测序分析，最终筛选到一株副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)TC16。该菌株已于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为：副干酪乳杆菌TC16LactobacillusparacaseiTC16，保藏编号为：CCTCCNO：M2017791。1)TC16菌株菌落与菌体形态：该菌株在MRS固体培养基上繁殖形成的菌落圆形，呈乳白色，表面隆起，光滑无皱褶，边缘清晰，生长较缓慢，培养72h菌落2-5mm；镜检显示细胞为长杆状，通常成短链，革兰氏阳性，不形成芽孢。生理生化特征：发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖产生乳酸，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆为阴性。2)TC16菌株的分子生物学鉴定将在80％甘油保存的菌种TC16接种到MRS液体培养基中，37℃摇床培养24h，经过平板划线分离复壮后备用。挑取菌株TC16单菌落一环，接种于YPD液体培养基中37℃摇床培养24h。用细菌基因提取试剂盒(tiangen)提取DNA，并用微量分光光度计检测提取的DNA浓度。以提取的DNA为模板，16S通用引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)和27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)为引物进行PCR扩增。PCR体系为：ddH2O28μL、5×PCRbuffer10μL、dNTPs(10mmol/L)5μL、引物1492R2μL、引物27F2μL、Taq酶1μL、模板2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火20s，72℃延伸60s，总延伸72℃5min，32循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了大小约1400bp的特异条带。将目的条带试剂盒回收后交由立菲生物技术有限公司(上海)进行DNA序列测定(测序引物为1492R和27F)。测序结果(SEQIDNO.1)提交至Genebank上进行Blast分析，显示该菌株与副干酪乳杆菌同源性为100％，由此确定菌株TC16为副干酪乳杆菌。实施例2副干酪乳杆菌TC16在养殖水体中去除亚硝酸盐实验取鱼塘水，一组按0.1％(w/v)的比例加入碳氮营养源(葡萄糖与大豆蛋白胨质量比1:1)，另一组不做处理。于500mL三本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株副干酪乳杆菌，其特征在于：所述副干酪乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2017791。
【技术特征摘要】
1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于：所述副干酪乳杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2017791。2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌的高密度固体发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的副干酪乳杆菌接种于MRS液体培养基，35-40℃培养24-36h，至OD600值达到2.0-5.0，得到种子液；(2)将培养的种子液按5-8％的接种量接种固体发酵培养基，37-42℃培养24-36h。3.根据权利要求2所述的副干酪乳杆菌的高密度固体发酵方法，其特征在于：所述固体发酵培养基配方为：麸皮250质量份，豆粕750质量份，料水比1:1，按麸皮豆粕总质量添加海藻糖5％、硫酸锰0.01％...
【专利技术属性】
技术研发人员：马良骁，荣克明，赵述淼，
申请(专利权)人：武汉市天辰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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