包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建制造技术

本发明专利技术涉及包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建，其有效成分别为一种光交联两亲性聚合物和精氨酸脱亚胺酶，该酶纳米反应器采用以下方法制成：采用pH诱导可光交联的羧甲基壳聚糖钠盐胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装精氨酸脱亚胺酶；通过紫外光光辐射交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器。本发明专利技术制得的精氨酸脱亚胺酶纳米反应器集自组装与载酶于一体，制备方法简单，并且对精氨酸代谢显示高活性，在癌症治疗等领域有潜在的应用价值。

Construction of arginine deimidification enzyme nanoreactor

The invention relates to the construction of a encapsulated arginine deimimide nanoreactor, which is effective as a light crosslinked two amphiphilic polymer and arginine deimimide, which is made by the following method: using pH to induce light crosslinked carboxymethyl chitosan sodium salt bundle into nanoscale, and to achieve mild conditions under mild conditions. The arginine deimimide was encapsulated, and the nanoscale structure was quickly locked through UV light radiation crosslinking to obtain a stable and highly active encapsulated arginine deimimide nanoscale. The preparation of the arginine deimimide nanoreactor is a combination of self-assembly and enzyme carrying. The preparation method is simple, and it shows high activity for arginine metabolism, and has potential application value in the field of cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建
本专利技术涉及酶纳米反应器，特别是一种包载ADI纳米反应器的构建。
技术介绍
最近，以肿瘤代谢为基础治疗某些恶性肿瘤的方法已成为人们关注的焦点。采用代谢酶降解或剥夺肿瘤存活所必须的氨基酸即所谓的氨基酸剥夺疗法，已经用于治疗急性淋巴细胞白血病。精氨酸是成年人体内一种非必需的氨基酸，它源于瓜氨酸通过两种关键酶催化转化合成。这两种酶分别是精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase1，ASS1)和精氨基琥珀酸裂解酶(argininosuccin-atelyase，ASL)，其中ASS1又是合成过程中的一个关键限速酶。由于缺乏ASS1，一些恶性细胞必须使用外源精氨酸，以满足其生长和增殖的需要。通过静脉注射精氨酸代谢酶来降解体循环中的精氨酸，可以切断肿瘤细胞从血液中摄取精氨酸，从而抑制肿瘤的生长和增殖。目前，可用于精氨酸降解或剥夺的酶包括两种类型：一种是来源于人体的精氨酸酶-1(Arg-1)，另一种是来源于细菌的ADI。Arg-1可将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素，但由于它对精氨酸的亲和力弱(Km＝45mM)，并且其最适pH>9，不适宜在生理条件下使用，因而其用途受到限制。ADI能催化精氨酸转化为瓜氨酸和氨，具有高活性。在正常细胞内，由于ASS1表达正常，代谢生成的瓜氨酸可以经过再循环重新生成精氨酸，而肿瘤细胞由于缺乏ASS1不能完成此循环。因此，采用ADI剥夺精氨酸对正常人细胞没有什么影响，但对快速增殖的肿瘤细胞来说影响很大，因而成为靶向治疗恶性肿瘤的一种新途径。尽管ADI具有优于Arg-1的一些好处，但其临床应用仍然有限，因为在体循环中它具有高免疫原性和短循环半衰期(大约5.0小时)。PEG修饰可以延长其血液循环寿命并降低其免疫原性，但其活性也显著降低，例如来自支原菌的ADI，其PEG化仅保留了原始酶活性的57％。解决此问题一个更有效的策略是将其包封在合适的载体中。酶纳米反应器(enzymenanoreactor)是一类具有仿生细胞结构及酶代谢功能的纳米囊反应系统。由于囊膜的半透性，封装在囊内的活性酶不能扩散出来，而酶的底物和代谢产物可以跨膜扩散。这种特性对保护酶在体内不受生理环境的影响，维持酶的高活性非常有利。目前，用于构建酶纳米反应器的载体主要有三种。脂质体(liposomes)、聚质体(polymersomes，一种由两亲性嵌段共聚物组装成的类似于脂质体结构的双分子层纳米囊)和基于层层自组装的纳米凝胶囊。前两种载体由于它们具有类似于细胞膜的双分子层结构，因而常被用作酶纳米反应器。但前者由于稳定差，包囊的酶容易从内部泄露到外部；后者虽然具有较高稳定性、能避免酶的泄露，但其双层膜中疏水链段形成的疏水层较厚，不利于亲水性小分子(如酶的底物及产物)自由透过，在用作酶纳米反应器时需要在其膜(或壳)中插入通道蛋白。相对于脂质体和聚质体，基于层层自组装的酶反应器可以通过选择不同的聚电解质种类或者控制交替吸附层数来调节囊膜的半透性，但该方法的一个最大缺点是聚电解质的交替吸附和纯化过程耗时长，制备效率低，而且最后去除模板也可能影响到酶的活性。羧甲基壳聚糖是天然高分子壳聚糖的一种羧甲基化产物，因其具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性，在医药、生化和生物医学工程等诸多领域备受关注，是常用的药用载体材料。使用羧甲基壳聚糖的另一个考虑是由羧甲基壳聚糖或其衍生物构建的纳米粒带负电荷。已有文献报道表明带负电荷的纳米粒显示出蛋白质对抗的潜力，某些能明显延长体循环的功能。中国专利文献201310112299.5公开了一种以羧甲基壳聚糖为载体材料的脲酶纳米反应器，但脲酶的封装过程伴随着超声，这会影响到脲酶的活性；另外，更重要的是以羧甲基壳聚糖为载体材料构建ADI纳米反应器未见报道。本专利技术所要解决的主要技术问题是：(1)ADI在体内的半衰期较短，在小鼠体内仅为4h。(2)ADI具有较强的抗原性。(3)PEG的修饰可以延长其血液循环寿命并降低其免疫原性，但其活性也显着降低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：为解决现有技术中存在的问题，构建一种用于催化降解或剥夺L-精氨酸的高活性、低免疫原性(或无免疫原性)的ADI纳米反应器，为治疗ASS缺陷类肿瘤提供技术支持。本专利技术解决其技术问题采用以下的技术方案：本专利技术提供的包载ADI纳米反应器的构建，其有效成分别为一种光交联两亲性聚合物和ADI，该酶纳米反应器采用以下方法制成：采用pH诱导可光交联的CMCNa胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装ADI；通过紫外光光辐射交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的包载ADI纳米反应器。上述方法中，按照CMCNa的结构单元与Az的摩尔比为1:(0.1～2)，将溶解在95％乙醇中的Az滴加到CMCNa水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到Az-CMCNa溶液。向该溶液中加入95％乙醇，过滤收集所得的沉淀，然后用95％的乙醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到Az-CMCNa。使用探针型超声波仪将Az-CMCNa水溶液超声处理3分钟得胶束分散液，然后向溶液中加入ADI，随后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与Az-CMCNa中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含ADI的纳米囊。将该囊溶液暴露于UV光20～30秒，以诱导壳中AZ基团原位交联，获得壳交联的ADI纳米反应器。所述CMCNa的DD≥90.0％，DS为0.4～1.2。所述紫外光波长是250～260nm。所述Az-CMCNa水溶液的浓度为0.1～1.0％。所述的ADI在胶束中的浓度为30～90ug/ml的浓度。本专利技术提供的ADI纳米反应器的制备方法，其步骤包括：(1)Az-CMCNa的制备将溶解在乙醇中的AZ滴加到CMCNa水溶液中，并将该混合物在室温下搅拌过夜，得到可光交联的羧甲基壳聚糖溶液。向溶液中加入95％的冷乙醇，通过过滤收集所得的沉淀，然后用95％的醇(v/v)洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到Az-CMCNa。(2)Az-CMCNa基胶束的制备使用探针型超声波仪将Az-CMCNa水溶液超声处理3分钟，得到Az-CMCNa基胶束分散液。(3)Az-CMCNa基ADI纳米反应器的制备在温和搅拌将ADI溶解在上述胶束溶液中，然后边搅拌边滴加稀盐酸溶液直到添加的盐酸与Az-CMCNa中离子化羧基的摩尔比为1:1，此时胶束转化成含ADI的纳米囊。将该囊溶液暴露于UV光20～30秒，以诱发壳中AZ基团原位交联，获得壳交联的ADI纳米反应器。本专利技术采用pH诱导Az-CMCNa胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装ADI；随后通过UV光辐射壳交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的ADI纳米反应器。与现有技术相比，该方法具有以下的主要优点：(1)囊的形成过程无需加入表面活性剂和有毒的有机溶剂，也无需使用模板核等其它物质。(2)ADI的包封过程在温和条件下进行，且壳交联反应迅速，形成的壳交联网络非常有利于酶底物和产物的通透性，同时又能阻止ADI酶向外泄漏，所得ADI纳米反应器显示出高催化活性(见表1)。(3)采用紫外光引发壳中叠氮基交联来锁定ADI纳米反应器的形态，获得的ADI纳米反应器在血清中显示出很本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建，其特征是该酶纳米反应器的有效成分别为一种光交联两亲性聚合物和精氨酸脱亚胺酶，精氨酸脱亚胺酶的英文缩写是ADI，该酶纳米反应器采用以下方法制成：采用pH诱导可光交联的羧甲基壳聚糖钠盐胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装ADI；通过紫外光光辐射交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的包载ADI的纳米反应器。

【技术特征摘要】
1.一种包载精氨酸脱亚胺酶纳米反应器的构建，其特征是该酶纳米反应器的有效成分别为一种光交联两亲性聚合物和精氨酸脱亚胺酶，精氨酸脱亚胺酶的英文缩写是ADI，该酶纳米反应器采用以下方法制成：采用pH诱导可光交联的羧甲基壳聚糖钠盐胶束转化成纳米囊，实现温和条件下封装ADI；通过紫外光光辐射交联，快速锁定纳米囊构造，获得稳定高活性的包载ADI的纳米反应器。2.根据权利要求1所述的包载ADI纳米反应器的构建，其特征在于按照羧甲基壳聚糖钠盐的结构单元与叠氮苯甲醛的摩尔比为1:(0.1～2)，羧甲基壳聚糖钠盐的英文缩写是CMCNa，叠氮苯甲醛的英文缩写是Az，将溶解在体积浓度为95％乙醇中的Az滴加到CMCNa水溶液中，在室温下搅拌8小时，得到可光交联的CMCNa水溶液，即Az-CMCNa溶液，向该溶液中加入体积浓度为95％乙醇，过滤收集所得沉淀，然后用体积浓度为95％的乙醇洗涤三次，最后于45℃真空干燥，得到Az-CMCNa。3.根据权利要求2所述的包载...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷以华，万燕鸣，代悦，潘茜，郑丽敏，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42