一种同时检测人EGFR基因45个突变位点的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人EGFR基因18‑21外显子45种突变的引物、探针、检测体系和试剂盒，本试剂盒基于寡核苷酸探针技术，建立了IR‑IC双质控反应体系，可以同时检测45种表皮生长因子受体EGFR的基因突变。本发明专利技术的引物、探针和试剂盒选择性高，特异性强，操作便捷，便于实验室标准化操作，方便快速，检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合服用抗EGFR的靶向治疗药物的人群时参考。

A kit for simultaneous detection of 45 mutations in human EGFR gene

The invention discloses a primer, probe, detection system and kit for detecting 45 mutations of the human EGFR gene 18 exon 21 exons. Based on the oligonucleotide probe technique, this kit has established a IR IC dual quality control reaction system, which can simultaneously detect the mutation of 45 epidermal growth factor receptor EGFR. The primers, probes and kits of the invention have high selectivity, strong specificity, convenient operation, convenient for laboratory standardization operation, convenient and fast, and the detection results can be used as reference for doctors to choose the people of non small cell lung cancer patients suitable for taking anti EGFR target therapy drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测人EGFR基因45个突变位点的试剂盒
本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说，涉及一种同时检测人EGFR基因18-21外显子45个突变位点的试剂盒，属于生物技术和医学领域。
技术介绍
人类表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成。其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码分子量为170kD的跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。EGFR与其配体结合后形成同源二聚体，也可与其他TK受体形成异源二聚体，导致胞内TK区的激活，启动一系列级联反应，将信号传到细胞核内，最终引起一系列相关基因活化，导致肿瘤细胞增殖、凋亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受，在肿瘤发生发展过程中扮演着重要角色。EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域的前4个外显子上(18～21外显子)，研究表明：EGFR基因18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)类药物的疗效较好，20外显子发生的突变常与TKIs耐药有关。中国肺癌患者中，EGFR的突变率约为30％～50％，其中18外显子上发生的点突变约占EGFR突变类型的5％左右，19外显子上发生的多种缺失突变约占EGFR突变类型的45％左右，21外显子上发生的L858R、L861Q点突变约占EGFR突变类型的40％～45％，20外显子上发生的T790M点突变约占EGFR突变类型的5％左右。目前检测基因突变的方法主要有以下几种：(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物(每个基因片段设计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。(2)变性高效液相色谱法(denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体位置，最终还需测序确认。(3)高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。(4)探针扩增阻滞突变法(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。此外，目前检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒只能检测几种或二十几种缺失突变，而对于其余突变位点的检测并没有相关报道，因此亟需一种覆盖更多突变位点且特异性强的EGFR基因突变检测试剂盒，为肺癌患者选择靶向治疗药物提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测人EGFR基因18-21外显子45个突变位点的试剂盒，检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合服用抗EGFR的靶向治疗药物的人群时参考。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：用于检测人EGFR基因18-21外显子45种突变的引物和探针，其中引物和探针的具体序列见下表：所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为FAM，TET，VIC，Cy3，Cy5，JOE或HEX，所述荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ；更优选地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ。进一步，人EGFR基因18-21外显子突变检测试剂盒，包括：检测EGFR基因18-21外显子突变的引物和探针，内参基因的引物和探针，内控基因的引物和探针，TaqDNA聚合酶，EGFR阳性质控品和dNTP。更进一步，内控基因为ACTB，其引物和探针序列如下：IC-F：5’-GCATGGAGTCCTGTGGCATC-3’SEQIDNO：27；IC-R：5’-GTACAGGTCTTTGCGGATGT-3’SEQIDNO：28；IC-pb：5’-CCTTCAACTCCATCATGAAGTGT-3’SEQIDNO：29；所述探针5’端标记荧光报告基团，且不同于步骤2所述探针标记的荧光报告基团，所述探针3’端标记荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ。更进一步，内参基因为ACTB，其引物和探针序列如下：IR-F：5’-CAGCAGATGTGGATCAGCA-3’SEQIDNO：30；IR-R：5’-CATAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’SEQIDNO：31；IR-pb：5’-ATGACGAGTCCGGCCCCTCCAT-3’SEQIDNO：32；所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标荧光淬灭基团；报告基团优选FAM，淬灭基团优选BHQ，为了判读结果方便，内参基因和突变基因探针的报告基团保持一致。进一步，利用上述引物和探针同时扩增待检测的45种突变基因序列。进一步，荧光PCR仪检测通道设定：StratageneMx3000P：突变检测通道为FAM，TET，VIC，Cy3，Cy5，JOE或HEX，内控检测通道不同于突变检测通道；优选地，突变检测通道为FAM通道，内控检测通道为HEX通道；二者同时设定为FAM和HEX通道，参比染料设置为“无”。反应程序设置如下：设置阴性质控品NC和阳性质控品PC用于结果判定。进一步，采用下述任意一种荧光PCR仪确定Ct值：(1)StratageneMx3000P荧光PCR仪：首先设定基线，选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测人EGFR基因18‑21外显子45个突变位点的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列分别为：(1)E18M‑F1：5’‑TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA‑3’SEQ ID NO：1；E18M‑F2：5’‑TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT‑3’SEQ ID NO：2；E18M‑F3：5’‑TCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC‑3’SEQ ID NO：3；E18M‑R：5’‑GTGCCAGGGACCTTACC‑3’SEQ ID NO：4；E18M‑pb：5’‑TATACACCGTGCCGAACGCACC‑3’SEQ ID NO：5；(2)E19M‑F1：5’‑CGTCGCTATCAAAACATCTC‑3’SEQ ID NO：6；E19M‑F2：5’‑CCGTCGCTATCAAGGAACC‑3’SEQ ID NO：7；E19M‑F3：5’‑CGTCGCTATCAAGGAGCC‑3’SEQ ID NO：8；E19M‑R：5’‑TGAGGTTCAGAGCCATGGA‑3’SEQ ID NO：9；E19M‑pb：5’‑AGCCAACAAGGAAATCCTCGATG‑3’SEQ ID NO：10；(3)E21M‑F1：5’‑AGATCACAGATTTTGGGCG‑3’SEQ ID NO：11；E21M‑R1：5’‑TTACTTTGCCTCCTTCTGCA‑3’SEQ ID NO：12；E21M‑pb1：5’‑CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATA‑3’SEQ ID NO：13；(4)E21M‑F2：5’‑ATTTTGGGCTGGCCAAACA‑3’SEQ ID NO：14；E21M‑R2：5’‑TTACTTTGCCTCCTTCTGCA‑3’SEQ ID NO：15；E21M‑pb2：5’‑CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATA‑3’SEQ ID NO：16；(5)E20M‑F1：5’‑CACCGTGCAGCTCATCAT‑3’SEQ ID NO：17；E20M‑R1：5’‑TGTTCCCGGACATAGTCCA‑3’SEQ ID NO：18；E20M‑pb1：5’‑AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCT‑3’SEQ ID NO：19；(6)E20M‑F2：5’‑GAAGCCTACGTGATGGCCAT‑3’SEQ ID NO：20；E20M‑R2：5’‑ATGAGCTGCACGGTGGAGGT‑3’SEQ ID NO：21；E20M‑pb2：5’‑CCGCCTGCTGGGCATCTGCC‑3’SEQ ID NO：22；(7)E20M‑F3：5’‑GATGGCCAGCGTGGACGG‑3’SEQ ID NO：23；E20M‑F4：5’‑GTGGACAACCCCCACCAC‑3’SEQ ID NO：24；E20M‑R：5’‑ATGAGCTGCACGGTGGAGGT‑3’SEQ ID NO：25；E20M‑pb：5’‑CCGCCTGCTGGGCATCTGCC‑3’SEQ ID NO：26；所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。...

【技术特征摘要】
1.用于检测人EGFR基因18-21外显子45个突变位点的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列分别为：(1)E18M-F1：5’-TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3’SEQIDNO：1；E18M-F2：5’-TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT-3’SEQIDNO：2；E18M-F3：5’-TCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC-3’SEQIDNO：3；E18M-R：5’-GTGCCAGGGACCTTACC-3’SEQIDNO：4；E18M-pb：5’-TATACACCGTGCCGAACGCACC-3’SEQIDNO：5；(2)E19M-F1：5’-CGTCGCTATCAAAACATCTC-3’SEQIDNO：6；E19M-F2：5’-CCGTCGCTATCAAGGAACC-3’SEQIDNO：7；E19M-F3：5’-CGTCGCTATCAAGGAGCC-3’SEQIDNO：8；E19M-R：5’-TGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’SEQIDNO：9；E19M-pb：5’-AGCCAACAAGGAAATCCTCGATG-3’SEQIDNO：10；(3)E21M-F1：5’-AGATCACAGATTTTGGGCG-3’SEQIDNO：11；E21M-R1：5’-TTACTTTGCCTCCTTCTGCA-3’SEQIDNO：12；E21M-pb1：5’-CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATA-3’SEQIDNO：13；(4)E21M-F2：5’-ATTTTGGGCTGGCCAAACA-3’SEQIDNO：14；E21M-R2：5’-TTACTTTGCCTCCTTCTGCA-3’SEQIDNO：15；E21M-pb2：5’-CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATA-3’SEQIDNO：16；(5)E20M-F1：5’-CACCGTGCAGCTCATCAT-3’SEQIDNO：17；E20M-R1：5’-TGTTCCCGGACATAGTCCA-3’SEQIDNO：18；E20M-pb1：5’-AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCT-3’SEQIDNO：19；(6)E20M-F2：5’-GAAGCCTACGTGATGGCCAT-3’SEQIDNO：20；E20M-R2：5’-ATGAGCTGCACGGTGGAGGT-3’SEQIDNO：21；E20M-pb2：5’-CCGCCTGCTGGGCATCTGCC-3’SEQIDNO：22；(7)E20M-F3：5’-GATGGCCAGCGTGGACGG-3’SEQIDNO：23；E20M-F4：5’-GTGGACAACCCCCACCAC-3’SEQIDNO：24；E20M-R：5’-ATGAGCTGCACGGTGGAGGT-3’SEQIDNO：25；E20M-pb：5’-CCGCCTGCTGGGCATCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫敏俐，李晖，陈钊，
申请(专利权)人：北京雅康博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11