APOA-1融合多肽及相关组合物和方法技术

公开了涉及ApoA‑1融合多肽的组合物和方法。融合多肽包含对应于ApoA‑1多肽或ApoA‑1模拟物的第一多肽区段，并且还可以包含二聚化结构域，例如像Fc区，其通常经由柔性接头在羧基末端与所述第一多肽区段连接。在一些实施方案中，融合多肽进一步包含羧基末端位于第一多肽区段并赋予第二生物学活性的第二多肽区段(例如RNA酶、对氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶、胆固醇酯转运蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、或与β淀粉样蛋白特异性结合的多肽)。还公开了包含本文公开的第一和第二ApoA‑1融合多肽的二聚体蛋白。融合多肽和二聚体蛋白可用在治疗方法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】APOA-1融合多肽及相关组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年9月8日提交的美国临时专利申请号62/215,256的权益，其全部内容通过引用并入本文。序列表的引用本申请含有一份已经以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。创建于2016年8月31日的所述ASCII副本被命名为“TRP_0110PC_20160831_Seq_Listing_ST25”，并且大小为161,132字节。
技术介绍
载脂蛋白A-I(ApoA-1)和高密度脂蛋白(HDL)在许多国家中心血管疾病是死亡的主要原因，导致全世界每年约有1670万人死亡。心血管疾病最常见的后果是心肌梗塞和中风，这是动脉粥样硬化的常见的潜在病因。自二十世纪七十年代以来的流行病学研究表明，低水平的高密度脂蛋白(HDL)与心肌梗塞风险增加是有关联的。这导致了针对HDL的新疗法的多种方式(参见Kingwell等人，NatureReviewsDrugDiscovery13：445-64，2014)，并达成共识认为胆固醇逆向转运(RCT)的过程是有益的HDL活动的中心，而不是简单地在没有RCT的情况下增加HDL。例如，在目前的临床试验中，通过用胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂抑制RCT来增加HDL的药物尚未有效。此外，近来已经认识到，HDL的测量水平不足以确定其在患者中的功能，因为HDL受到氧化和糖化的损伤，包括在化疗期间以及在患有神经退行性疾病的患者中。参见Keeney等人，ProteomicsClinAppl.7：109-122，2013。载脂蛋白A-1(ApoA-1)是HDL的主要蛋白组分。Phillips，JournalofLipidResearch54：2034-2048，2013。人ApoA-1是一种243个氨基酸的蛋白质，具有跨越残基44-243的一组八个22聚体和两个11聚体两亲性α-螺旋。Lund-Katz和Phillips，SubcellBiochem.51：183-227，2010。分子的氨基末端三分之二处的螺旋形成了螺旋束结构，而羧基末端区域形成了对于脂质结合很重要的单独的、相对无序的结构域。C末端片段与脂质的相互作用诱导ApoA-1结构的构象变化，从而增加分子的α-螺旋含量并使得N末端螺旋束随后打开。参见，同前。ApoA-1的脂质亲和力赋予了类似洗涤剂的性质，并且其可以溶解磷脂以形成包含一段磷脂双分子层和两个ApoA-1分子的盘状HDL颗粒，这两个ApoA-1分子以反平行、双带构型排列在盘的边缘的周围。Phillips，同上。构象适应性ApoA-1还赋予HDL颗粒(包括不同大小的盘状颗粒以及球形HDL颗粒)稳定性。参见，同前。这些特征使得ApoA-1能够与ABCA1配合，介导细胞磷脂和胆固醇的外流以及稳定的HDL颗粒的产生。参见Phillips，同上；Lund-Katz和Phillips，同上。由于其在HDL颗粒形成和功能中的重要作用，ApoA-1已经成为几种HDL靶向治疗策略的焦点。然而，包括了增加ApoA-1合成的烟酸和贝特类的药物也降低VLDL的浓度，并因此对HDL是特异性的。烟酸的临床试验由于缺乏效力而停止，而在荟萃分析(meta-analysis)中发现激活过氧化物增殖物激活受体(PPAR)的贝特类导致了主要心血管事件减少10％(p<0.05)，冠状动脉事件减少13％(p<0.0001)。参见Jun等人，Lancet375：1875，2010。因为需要更有效的疗法，在临床前开发中还有其他几种口服活性药物可以增加ApoA-1。参见Kingwell等人，同上。增加ApoA-1的可替代的方法是直接注射纯化的蛋白质。参见例如Kingwell等人，Circulation128：1112，2013。已经从人血浆(重构的HDL)中纯化了ApoA-1并在临床试验中进行了测试。重组ApoA-1也在细菌和哺乳动物表达系统中表达，并在临床试验中进行测试。这些研究已经表明，在小型(47-60名患者)临床试验之后，如通过血管内超声(IVUS)测量的，将用磷脂重构的ApoA-1注入到前β-HDL中导致了斑块体积的减少和斑块形态的改善。虽然有希望，但使用天然或重组ApoA-1有一些局限性，包括由于较短的ApoA-1半衰期而需要每周给药以及较高的生产成本。高度活跃的ApoA-1突变体重组ApoA-1Milano在细菌细胞中表达，并且在急性冠脉综合征患者的临床试验中进行测试(参见Nissen等人，JAMA290：2292，2003)，其中可见斑块体积减少。虽然这项研究被认为是对HDL的假设进行直接测试和确认的第一个研究，但由于低表达水平和高制造成本而对于在细菌系统中产生的ApoA-1尚未取得进展。在哺乳动物细胞中产生的重组ApoA-1在临床试验中取得了进一步的进展，包括最近完成的II期研究。由CerenisTherapeutics开发的CER-001是由哺乳动物细胞产生并与特定脂质配制形成前β样HDL颗粒的重组ApoA-1。据Cerenis介绍，在MODE试验(NCT01412034)中，在家族性高胆固醇血症患者中，CER-001达到了通过MRI测量的颈动脉斑块体积减少的主要目的。在CHI-SQUARE试验(NCT01201837)中，Cerenis宣布在急性冠脉综合征患者中CER-001与基线水平相比减少了斑块体积，但是与安慰剂相比则这种减少并不显著。在另一项对恒河猴的研究中，每隔一天以相对较高的剂量(30、100和300mg/kg)给予用脂质(POPC)重构的ApoA-1Milano，输注21次。Kempen等人，J.Lipid.Res.54：2341-2353，2013。药物输注迅速降低了内源性胆固醇酯化率，由于缺乏LCAT活化而使较大的ApoE富集颗粒的形成增加，并且由于持续刺激ABCA1介导的外流而引起游离胆固醇的大量增加。参见，同前。这些结果显示，在不能通过正常的代谢途径来进行处理的情况下，输注大量重构ApoA-1Milano通过增强胆固醇外流而破坏HDL代谢。虽然HDL输注疗法的前景非常有希望，但是仍需要克服了目前方法的一些局限性的改进的重组ApoA-1分子。已经产生了几种重组ApoA-1融合蛋白，包括在具有His标签的细菌中产生的ApoA-1以简化纯化。参见例如Prieto等人，ProteinJ.31：681-688，2012；Ryan等人，ProteinExpr.Purif.27：98-103，2003。在另一个实施例中，IFNα通过3aa(GlyAlaPro)接头连接到ApoA-1的氨基末端。参见Fioravanti等人，J.Immunol.188：3988-3992，2012。这种构建体中的接头是通过对限制性内切酶进行选择而形成的，并且通过腺病毒递送来测试融合蛋白以靶向肝脏并降低IFNα疗法的毒性。ApoA-1也已经与Fc结构域(ApoA-1-Ig)融合，并且可以从CreativeBiomart(cat.No.APOA-1-33H)和LifeTechnologies(Cat#10686-HO2H-5)进行商购。然而，这种ApoA-1-Ig分子具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从氨基末端位置到羧基末端位置包含ApoA1‑L1‑D的融合多肽，其中：ApoA1是包含与SEQ ID NO:2的氨基酸残基19‑267或25‑267具有至少95％的同一性的氨基酸序列的第一多肽区段，其中，所述第一多肽区段具有胆固醇外流活性；L1是第一多肽接头；并且D是二聚化结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.08 US 62/215,2561.一种从氨基末端位置到羧基末端位置包含ApoA1-L1-D的融合多肽，其中：ApoA1是包含与SEQIDNO:2的氨基酸残基19-267或25-267具有至少95％的同一性的氨基酸序列的第一多肽区段，其中，所述第一多肽区段具有胆固醇外流活性；L1是第一多肽接头；并且D是二聚化结构域。2.权利要求1的融合多肽，其中，L1包含至少两个氨基酸残基。3.权利要求1的融合多肽，其中，L1包含至少16个氨基酸残基。4.权利要求1的融合多肽，其中，L1由从2至60个氨基酸残基组成。5.权利要求1的融合多肽，其中，L1由从5至40个氨基酸残基组成。6.权利要求1的融合多肽，其中，L1由从15至40个氨基酸残基组成。7.权利要求1的融合多肽，其中，L1由从16至36个氨基酸残基组成。8.权利要求1的融合多肽，其中，L1由16个氨基酸残基、21个氨基酸残基、26个氨基酸残基、31个氨基酸残基或36个氨基酸残基组成。9.权利要求8的融合多肽，其中，L1具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQIDNO:22的残基268-283、SEQIDNO:26的残基268-288、SEQIDNO:2的残基268-293、SEQIDNO:2的残基268-293、SEQIDNO:54、或SEQIDNO:24的残基268-303。10.权利要求1至9中任一项的融合多肽，其中，所述第一多肽区段具有SEQIDNO:2的残基19-267或25-267中所示的氨基酸序列。11.权利要求1至10中任一项的融合多肽，其中，D是免疫球蛋白重链恒定区。12.权利要求11的融合多肽，其中，所述免疫球蛋白重链恒定区是免疫球蛋白Fc区。13.权利要求12的融合多肽，其中，所述Fc区是人Fc区。14.权利要求13的融合多肽，其中，所述人Fc区是相对于野生型人类序列包含一个或多个氨基酸取代的Fc变体。15.权利要求13或14的融合多肽，其中，所述Fc区是人γ1Fc区或人γ3Fc区。16.权利要求14的融合多肽，其中，所述Fc区是其中Eu残基C220被丝氨酸替换的人γ1Fc变体。17.权利要求16的融合多肽，其中，Eu残基C226和C229各自被丝氨酸替换。18.权利要求17的融合多肽，其中，Eu残基P238被丝氨酸替换。19.权利要求15的融合多肽，其中，所述Fc区是其中Eu残基P331被丝氨酸替换的人γ1Fc变体。20.权利要求16至18中任一项的融合多肽，其中，Eu残基P331被丝氨酸替换。21.权利要求14和16至20中任一项的融合多肽，其中，所述Fc变体包含相对于所述野生型人类序列降低了糖基化的氨基酸取代。22.权利要求21的融合多肽，其中，Eu残基N297被另一个氨基酸替换。23.权利要求14和16至22中任一项的融合多肽，其中，所述Fc变体包含增加或降低与Fc受体的结合亲和力的氨基酸取代。24.权利要求23的融合多肽，其中，所述Fc变体包含增加或降低与FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的至少一者的结合亲和力的氨基酸取代。25.权利要求23或24的融合多肽，其中，Fc变体包含增加或降低与新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力的氨基酸取代。26.权利要求12的融合多肽，其中，所述Fc区具有以下所示的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:2的残基294-525或294-524，或(ii)SEQIDNO:13的残基294-525或294-524。27.权利要求1的融合多肽，其中，所述融合多肽包含与以下各项具有至少95％的同一性的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:2的残基19-525、19-524、25-525或25-524，(ii)SEQIDNO:13的残基19-525、19-524、25-525或25-524，(iii)SEQIDNO:20的残基19-501、19-500、25-501或25-501，(iv)SEQIDNO:22的残基19-515、19-514、25-515或25-514，(v)SEQIDNO:26的19-520、19-519、25-520或25-519，或者(vi)SEQIDNO:24的残基19-535、19-534、25-535或25-534。28.权利要求27的融合多肽，其中，所述融合多肽包含以下所示的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:2的残基19-525、19-524、25-525或25-524，(ii)SEQIDNO:13的残基19-525、19-524、25-525或25-524，(iii)SEQIDNO:20的残基19-501、19-500、25-501或25-501，(iv)SEQIDNO:22的残基19-515、19-514、25-515或25-514，(v)SEQIDNO:26的19-520、19-519、25-520或25-519，或者(vi)SEQIDNO:24的残基19-535、19-534、25-535或25-534。29.权利要求1至27中任一项的融合多肽，进一步包含位于所述二聚化结构域的羧基末端的第二多肽区段，其中，所述第二多肽区段选自下组：RNA酶、对氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶、以及胆固醇酯转运蛋白。30.一种从氨基末端位置到羧基末端位置包含ApoA1-L1-D-L2-P的融合多肽，其中：ApoA1是包含与SEQIDNO:2的氨基酸残基19-267或25-267具有至少95％的同一性的氨基酸序列的第一多肽区段，其中，所述第一多肽区段具有胆固醇外流活性；L1是第一多肽接头；D是二聚化结构域；L2是第二多肽接头，其中，L2是可选地存在的；并且P是选自下组的第二多肽区段：RNA酶、对氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶、以及胆固醇酯转运蛋白。31.权利要求30的融合多肽，其中，L1包含至少两个氨基酸残基。32.权利要求30的融合多肽，其中，L1包含至少16个氨基酸残基。33.权利要求30的融合多肽，其中，L1由从2至60个氨基酸残基组成。34.权利要求30的融合多肽，其中，L1由从5至40个氨基酸残基组成。35.权利要求30的融合多肽，其中，L1由从15至40个氨基酸残基组成。36.权利要求30的融合多肽，其中，L1由从16至36个氨基酸残基组成。37.权利要求30的融合多肽，其中，L1由16个氨基酸残基、21个氨基酸残基、26个氨基酸残基、31个氨基酸残基或36个氨基酸残基组成。38.权利要求37的融合多肽，其中，L1具有以下各项中所示的氨基酸序列：SEQIDNO:22的残基268-283、SEQIDNO:26的残基268-288、SEQIDNO:2的残基268-293、SEQIDNO:54或SEQIDNO:24的残基268-303。39.权利要求30至38中任一项的融合多肽，其中，所述第一多肽区段与SEQIDNO:2的氨基酸残基19-267或25-267具有至少95％的同一性。40.权利要求39的融合多肽，其中，D是免疫球蛋白重链恒定区。41.权利要求40的融合多肽，其中，所述免疫球蛋白重链恒定区是免疫球蛋白Fc区。42.权利要求41的融合多肽，其中，所述Fc区是人Fc区。43.权利要求42的融合多肽，其中，所述人Fc区是相对于野生型人类序列包含一个或多个氨基酸取代的Fc变体。44.权利要求42或43的融合多肽，其中，所述Fc区是人γ1Fc区或人γ3Fc区。45.权利要求43的融合多肽，其中，所述Fc区是其中Eu残基C220被丝氨酸替换的人γ1Fc变体。46.权利要求45的融合多肽，其中，Eu残基C226和C229各自被丝氨酸替换。47.权利要求46的融合多肽，其中，Eu残基P238被丝氨酸替换。48.权利要求44的融合多肽，其中，所述Fc区是其中Eu残基P331被丝氨酸替换的人γ1Fc变体。49.权利要求45至47中任一项的融合多肽，其中，Eu残基P331被丝氨酸替换。50.权利要求41和43至49中任一项的融合多肽，其中，所述Fc变体包含相对于所述野生型人类序列降低糖基化的氨基酸取代。51.权利要求50的融合多肽，其中，Eu残基N297被另一个氨基酸替换。52.权利要求41和43至51中任一项的融合多肽，其中，所述Fc变体包含增加或降低对Fc受体的结合亲和力的氨基酸取代。53.权利要求52的融合多肽，其中，所述Fc变体包含增加或降低对FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的至少一者的结合亲和力的氨基酸取代。54.权利要求52或53的融合多肽，其中，Fc变体包含增加或降低与新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力的氨基酸取代。55.权利要求41的融合多肽，其中，所述Fc区具有SEQIDNO:2的残基294-525或SEQIDNO:13的残基294-525中所示的氨基酸序列。56.权利要求30至55中任一项的融合多肽，其中，存在L2，并且具有SEQIDNO:4的残基526-541中所示的氨基酸序列。57.一种融合多肽，包含：包含与SEQIDNO:2的氨基酸残基19-267或25-267具有至少95％的同一性的氨基酸序列的第一多肽区段，其中，所述第一多肽区段具有胆固醇外流活性；以及位于第一多肽区段的羧基末端的第二多肽区段，其中，所述第二多肽区段选自下组：RNA酶、对氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶、以...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·海登莱德贝特，J·A·莱德贝特，V·莫特斯，
申请(专利权)人：赛瑞品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US