一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术试剂盒包括：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。本发明专利技术试剂盒检测方法操作简单、降低了检测成本，且灵敏性高、特异性强，可以应用于复杂样品的检测。并且本发明专利技术试剂盒还可应用于PNK活性抑制性检测中。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
多核苷酸激酶(PNK)是一种能够催化磷酸基团从ATP的γ位转移到DNA的5’-羟基末端进而生成5’-磷酸末端的DNA末端加工酶。这种PNK催化的磷酸化反应在DNA重组、DNA复制和DNA损伤修复等很多细胞过程中都发挥着重要的作用；PNK表达和活性异常与多种人类疾病密切相关；目前，PNK被认为是一种潜在的可用于癌症治疗的靶物质。现有技术中，荧光检测方法因其便利性和灵敏性成为PNK活性检测最常用的方法。目前已有多种荧光检测方法用于PNK活性的分析测定，如：基于金纳米颗粒的荧光恢复检测法，基于免淬灭发夹型探针的荧光检测法，纸基荧光检测法，基于氧化石墨烯的分子信标荧光检测法以及基于催化活性分子信标组装的荧光检测法等。这些荧光检测方法在PNK活性的定量测定中都表现出良好的性能，但这些方法大多需要昂贵的荧光标记；同时由于不彻底的荧光淬灭效应还可能产生假阳性干扰。此外，因为缺乏有效的信号放大策略，这些方法的灵敏度普遍较低，多数方法的灵敏度还不足以支持实际应用。与传统的聚合酶链式反应(PCR)及其他核酸扩增方法相比，指数扩增反应(EXPAR)具有恒定的反应温度、较高的扩增效率和较快的扩增动力学等显著优点。通过将DNA聚合酶介导的链延长反应和切刻酶介导的单链切刻反应结合起来，指数扩增反应(EXPAR)能够快速在恒定温度下实现106倍的信号扩增。指数扩增反应(EXPAR)最初被用于检测DNA，后来扩展到用于检测microRNA、端粒酶、转录因子和致病菌等其他靶物质。
技术实现思路
为了解决上述方法存在的问题，本专利技术提供了一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术第一个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。本专利技术第二个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)将探针A、探针S和1×的NEBuffer2混合后在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却30分钟以上至室温，得反应体系I；(2)向上述反应体系I中加入三磷酸腺苷、λ核酸外切酶以及待测PNK于37℃孵育15～30分钟后，在70～80℃水浴中加热5～15分钟，缓慢冷却至室温，得反应体系II；(3)将上述反应体系II置于冰上，加入模板DNA、10×NEBuffer2混合均匀后加入混合液A，混合均匀后立即将混合液置于实时荧光定量系统中进行荧光监测。本专利技术第三个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒在PNK活性抑制性检测中的应用。本技术方案是基于磷酸化作用触发两级恒温指数扩增超灵敏检测PNK的免标记荧光定量方法。当体系中没有靶物质PNK存在时，无法引发任何扩增反应；反之，当靶物质PNK存在时，经过PNK催化的磷酸化作用和λ核酸外切酶的消化作用，探针在DNA聚合酶和切刻酶的作用下可以引发第一级链置换反应，产生大量的触发序列，进而启动第二级链置换反应，最终实现指数扩增，PNK的活性信号通过信号转换实现有效放大；最后利用SYBRgreenI染料作为荧光指示剂，可以轻松实现对荧光信号的免标记实时监测。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术优点：(1)本专利技术试剂盒操作简单，成本低廉：本专利技术利用两级恒温指数扩增反应和SYBRGreenI染料实现PNK活性的实时定量检测；相比荧光标记等方法，本专利技术无需昂贵的荧光标记，大大降低了实验成本；相比聚合酶链式反应(PCR)，本专利技术无需使用昂贵的热循环仪，恒温下即可完成扩增反应，降低了实验成本；(2)本专利技术试剂盒效率高，效果好：本专利技术两级恒温指数扩增反应在60分钟内即可达到较高的扩增效率，实现PNK活性的快速高效检测；相比其他方法因不彻底的荧光淬灭效应可能会产生假阳性的干扰，本专利技术试剂盒直接使用SYBRGreenI作为荧光指示剂，免受假阳性干扰；(3)本专利技术试剂盒灵敏度高，应用潜力巨大：本专利技术由PNK和λ核酸外切酶共同实现的磷酸化-外切酶消化反应过程能够将PNK的催化活性信号高效率、高特异性地转化为可扩增的核酸信号；同时，基于链置换反应触发指数扩增反应的两级恒温指数扩增反应的扩增效率也很高；此外，结合荧光指示剂SYBRGreenI，可以产生用于实时定量测定的荧光信号，因此本专利技术试剂盒的检测灵敏度很高，检测限低至0.0002单位每毫升，优于大多数现有的PNK活性检测方法；在实际样品内进行PNK活性测定时，本试剂盒的灵敏度甚至可以达到单细胞水平，有很大的实际应用价值，展现出巨大的临床诊断和生物研究潜力；(4)特异性好：由于本专利技术试剂盒中对探针的设计是基于沃森-克里克碱基互补配对原则，很大程度上避免了探针之间的非特异性结合；同时，本专利技术试剂盒通过PNK和λ核酸外切酶共同实现的磷酸化-外切酶消化反应，探针S对探针A3’末端的“封锁”作用可以避免非特异性扩增反应的发生，大幅降低了后续非特异性扩增可能产生的干扰信号；(5)应用范围广本技术专利技术试剂盒既能实现对PNK催化活性的实时定量检测，也能很好地开展关于PNK抑制实验的实时检测；此外，本专利技术试剂盒还可用于成分复杂的实际样品(癌细胞)内PNK催化活性的实时定量检测，灵敏度可达单细胞水平。附图说明图1：基于两级恒温扩增反应在单细胞水平检测多核苷酸激酶(PNK)的方法原理说明。图2：(A)对PNK催化磷酸化反应所触发的λ外切酶消化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；(B)对磷酸化反应触发的两级恒温指数扩增反应的实时定量分析。PNK和λ核酸外切酶的浓度分别为5单位每毫升、0.25单位每微升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升。图3：(A)不同PNK浓度下的实时荧光定量检测结果；(B)POI值与PNK浓度的线性关系图；插图：POI值与PNK浓度对数的线性关系图；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差；探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升。图4：利用不同的生物酶作为靶物质进行扩增反应所得的ΔPOI值比较；所用生物酶的浓度均为0.5单位每毫升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。图5：不同的PNK抑制剂的抑制效果，(A)二磷酸腺苷；(B)硫酸铵；(C)磷酸氢二钠；PNK的浓度为0.5单位每毫升，探针和模板DNA的浓度分别为100纳摩尔每升和50纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。为了提高PNK检测的灵敏度和准确性，降低检测成本，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。

【技术特征摘要】
1.一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。2.根据权利要求1所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，混合液A包括：0.05～0.15毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.1～0.3单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶，0.05～0.15单位每微升的KF聚合酶、200～300微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreenI染料。3.根据权利要求2所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，混合液A包括：0.1毫克每毫升的牛血清白蛋白、0.2单位每微升的Nt.BbvCI切刻酶、0.1单位每微升的KF聚合酶、250微摩尔每升的三磷酸脱氧核苷酸以及10×的SYBRgreenI染料。4.根据权利要求1所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，所述探针A的核苷酸序列为5’-GCACAAAGGACTGAGGCTGAGGGTTGCGCATCTGCTATGAAACAAGCCAGATGCTCAAC-3’，如SEQIDNO.1所示，其5’末端作磷酸化修饰；探针S的核苷酸序列为5’-GTTGAGCATCTGGCTTGTTTCATAGCAGATGTTTTTT-3’，如SEQIDNO.2所示，其5’末端为羟基末端。5.根据权利要求1所述检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征在于，所述模板DNA核苷酸序列为5’-GCACAAAGGACTGAGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，马飞，刘萌，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37